Dosage immunosorbant lié à l’enzyme – Wikipedia
Dosage immuno-enzymatique (ELISA) désigne une procédure de détection basée sur des anticorps ( Essai ). Comme le radio-immunasse (RIA), l’ELISA appartient au groupe de processus d’essai immunitaire, mais n’est pas basé sur une mesure de la radioactivité, mais sur une réaction couleur enzymatique et est donc l’un des processus d’immunadsorption enzymatique (EIA). L’antigène à démontrer est initialement lié et enrichi d’une plaque de microtite à une plaque de microtite, un deuxième anticorps couplé enzymatique (synonyme: Anticorps de détection ) conduit ensuite à la réaction d’un substrat de colorant.
À l’aide de l’ELISA, des protéines (par exemple des anticorps) et des virus, mais aussi des composés moléculaires faibles tels que les hormones, les toxines et les pesticides peuvent être détectés dans un échantillon (sérum sanguin, lait, urine, etc.). Ici, vous profitez de la propriété d’anticorps spécifiques qui se lient (antigène) au matériau à démontrer. Un anticorps est auparavant marqué d’une enzyme. La réaction catalysée par l’enzyme rapporteur sert de preuve de la présence de l’antigène. Le substrat So-Called est mis en œuvre par l’enzyme, le produit de réaction peut généralement être détecté par enveloppe de couleur, peut-être également par chimioluminescence. La résistance du signal est fonction de la concentration d’antigène qui peut être déterminée avec précision avec un photomètre, afin que ELISA puisse également être utilisé comme mesures multiples pour des preuves quantitatives.
La peroxydase de raifort (HRP, d’Engl. peroxydase de raifort ), la phosphatase alcaline (AP) ou moins a également utilisé la glucose oxydase (Dieu).
Dans le cas de la phosphatase alcaline, substrat de colorant (synonyme: chromogène) z. B. p -Nitrophénylphosphate (PNPP), tandis que dans la peroxydase principalement O -Phénylindiamine (OPD) est utilisé. La phosphatase alcaline divise le phosphate du phosphate de nitrophényle incolore et il surgit p -Nitrophénol, qui est un jaune faible. Le changement de concentration du colorant créé par la réaction enzymatique peut être suivi avec un photomètre selon la loi Lambert-Beer. L’intensité de la couleur augmente avec la concentration du nitrophénol résultant et donc la concentration de l’antigène à déterminer dans l’échantillon par rapport à une série de dilution avec des concentrations connues ( Série standard ).
Le précurseur des Elisas est l’essai radio-immunmuno depuis 1960. [d’abord] Le couplage direct des protéines était nécessaire pour des preuves enzymatiques afin que le signal du rapporteur ne se produise que couplé à l’anticorps de liaison spécifique. Le couplage chimique des protéines a également été développé par Stratis Avrameas et G. B. Pierce. [2] L’adsorption des protéines sur les surfaces avait déjà été examinée par Jerker Porath en 1966. [3] L’ELISA a également été développée en 1971 par deux groupes de travail, dont Peter Perlmann et Eva Engvall en Suède. [4] [5]
Au lieu d’un anticorps de détection couplé enzymatique, la combinaison d’un anticorps de détection non nupulé et d’un (troisième) anticorps secondaire (troisième) ( secondaire Parce que c’est un anticorps contre les anticorps, l’anglais. anticorps secondaire ), à laquelle une enzyme était liée (voir Fig.). Cela nécessite une autre étape d’incubation et de lavage. Le tampon TBS-T est principalement utilisé comme tampon. Bien que plus complexe, l’utilisation d’un conjugué d’anticorps secondaire a l’avantage que le coût de la fabrication de nombreux anticorps primaires couplés enzymes différents, qui ne sont spécifiques que pour un antigène, peuvent être évités. Les anticorps secondaires découplés enzymatiques utilisés, qui peuvent également être liés à toute la bouillie initiale d’une espèce comme anticorps polyclonal avec divers épitopes dans la région constante (région FC), peuvent être utilisés plus larges et conduire à un renforcement du signal. De plus, les anticorps secondaires-conjugués en ézyme peuvent être utilisés par une espèce pour une variété de tests A immunitaire différents en raison de la spécificité des régions FC d’un type d’anticorps, de sorte que les anticorps secondaires sont un produit de production de masse industriel plus efficace.
Un autre renforcement du signal fréquent peut être effectué en liant les conjugués de streptavidine ou d’avidine aux anticorps de détection biotinylés dans la dernière étape d’incubation. La détection avec le conjugué de l’enzyme d’avidine (stress) conduit également à un renforcement du signal en raison de plusieurs biotinylation des anticorps primaires et de la liaison résultante de plusieurs molécules de reporter.
En utilisant la fluorescence ou la réaction en chaîne par polymérase, les systèmes de rapporteurs modernes permettent parfois des sensibilités plus élevées (par exemple Immuno-PCR) ou des dispositions parallèles dans une approche ( Multiplex ), mais ne sont pas des elisas au sens plus stricte. [6]
Avec cette enzyme-couplée immunitaire adsorption Tester (eia) L’antigène est directement et sans un revêtement de revêtement Adsorbé sur la surface du polystyrène d’une plaque de microtite, ce qui signifie que les concentrations d’anticorps peuvent être mesurées ci-dessous par rapport à une série standard.
L’une des techniques ELISA ( Sandwich-elisa ou Antigène-elisa ) Utilisez deux anticorps (AK), qui sont tous deux spécialement liés à l’antigène à démontrer. Il est important que les deux anticorps se lient à l’antigène à différents endroits (épitopes), sinon ils se gêneraient. Le premier anticorps (anglais anticorps envelopper ou anticorps de capture ) est à une phase fixe (principalement des plaques de microtite avec 96 puits les dépressions mentionnées). L’échantillon avec l’antigène à prouver est alors dans le puits donné et incubé pendant un certain temps. Pendant ce temps, l’anticorps lié à la plaque se lie à l’antigène de l’antigène dans l’échantillon. Une fois la phase d’incubation expirée, la plaque est lavée: les composants non liés de l’échantillon sont supprimés, et il ne reste que ce manteau -Tibodies Antigène lié. Un deuxième anticorps de détection non marqué primaire est ajouté pour terminer le sandwich. Les anticorps de détection en excès sont à nouveau lavés en lavant l’assiette. Le résultat peut être quantifié en ajoutant un anticorps secondaire marqué qui se lie au deuxième anticorps primaire et catalyse la réaction de couleur enzymatique. [7] Pour des preuves quantitatives, une série avec des concentrations d’antigènes connues ( Série standard ) réalisée pour obtenir une courbe d’étalonnage pour le signal mesuré (extinction optique, intensité émise).
Souvent, cependant, le Immunassage kompétitif (Test d’immunadsorption couplée enzymatique, EIA) Utilisé. Aucune seconde, un anticorps marqué est utilisé pour la détection, mais un antigène concurrent marqué (une connexion synthétique qui est structurellement similaire aux analytes et se lie également à l’anticorps). Il y a donc une compétence (compétition) entre l’analyt et le concurrent autour d’un lieu de liaison sur l’anticorps. Inversement, le signal concerne la concentration d’analyse: peu d’analyse = presque tous les lieux d’anticorps sont occupés par des concurrents marqués = forte réaction couleur; Beaucoup d’analyses = réaction de couleur faible.
Les systèmes de preuve utilisés (enzymes / substrats) sont généralement les mêmes que dans l’ELISA.
Une forme d’angle sigmoïde se produit lorsque vous appliquez le logarithme de concentration sur l’axe x et l’extinction (= OD = densité optique = absorption) sur l’axe y. Cette forme de représentation est le diagramme semi-logarithmique.
Afin de pouvoir calculer une régression linéaire, vous devez linéariser ces sigmoïdes au préalable. À cette fin, la dimension de l’axe x est maintenue et l’axe y se calcule en valeurs logit. Une ligne droite doit être créée. Cette forme de présentation est appelée Logit-Logit-Plot, Logit-Log-Plot ou Logit-Plot.
Afin de pouvoir calculer les valeurs logit à partir des valeurs d’extinction, vous devez d’abord normaliser les valeurs d’extinction (w) afin qu’elles couvrent une zone de 0 à 1. Pour ce faire, vous avez besoin de l’asymptote inférieure (U) et supérieure (O) de la courbe sigmoïde.
Fonction d’inversion:
Ces valeurs d’extinction normalisées entrent ensuite dans l’équation logit (L):
Fonction d’inversion:
Les paires de valeurs du tracé logit-log à partir de la valeur x (= logarithme naturel de concentration) et la valeur y (logit des valeurs d’extinction normalisées (L)) entrent ensuite dans le calcul de la régression linéaire. Cela offre ensuite la hauteur (a) et la pente (b) de la ligne droite:
Fonction d’inversion:
Pour l’interpolation de valeurs mesurées inconnues sur la courbe d’étalonnage créée de cette manière, souvent mal appelée une courbe d’étalonnage, les fonctions d’inversion sont alors nécessaires. La plus haute précision est atteinte près du tournant au milieu du sigmoïde, car sa montée est la plus grande à ce stade. La moindre précision se produit près de vos asymptotes.
Si vous pouvez calculer une courbe de mesure à partir de plusieurs mesures différentes à l’aide des asymptrités de la courbe d’étalonnage, c’est la plus précisément si vous comparez la concentration de point de paragraphe de la courbe d’étalonnage avec l’éclairage du point de tournant de la courbe de mesure. Les asymptrités des courbes de mesure sont ignorées car tous les résultats de mesure doivent être référés au tournant de la courbe d’étalonnage, qui peut être trouvé dans les valeurs y n = 0,5 dans le diagramme semi-émigarithmique, identique à L = 0 dans le tracé logit logit. Avec la représentation semi-conductrice de la courbe de mesure, le logarithme naturel de la dilution de la dilution sert d’axe x, car la concentration est encore inconnue pour les valeurs mesurées avant le calcul.
En principe, il est également possible à la place des logarithmes naturels LN Pour utiliser les logarithmes décadicaux ou ceux avec la base de 2. Au lieu de la dilution, seule la dilution (dilution) peut être utilisée. Il est également permis de calculer la valeur de n que de 0 à 100%, à condition que les équations soient modifiées correctement. Cependant, il ne serait pas correct de calculer la logit directement à partir des valeurs d’extinction non normalisées W.
- R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, J. Kuby: Dosage immuno-enzymatique. Dans: Immunologie. 5e édition. W. H. Freeman, New York 2003, ISBN 0-7167-4947-5, pp. 148-150.
- ↑ R. Yalow, S. Personne: Immunodosage de l’insuline plasmatique endogène chez l’homme . Dans: J. Clin. Investir . 39e année, Non. 7 , 1960, S. 1157–1175 , est ce que je: 10.1172 / jci104130 , PMID 13846364 , PMC 441860 (Texte complet gratuit).
- ↑ R. Lequin: Immunoessai enzymatique (EIA) / test immuno-enzymatique (ELISA) (ELISA) . Dans: Clinquant Chem . 51e année, Non. douzième , 2005, S. 2415–2418 , est ce que je: 10.1373 / CLINCHEM.2005.051532 , PMID 16179424 .
- ↑ L. large, Jerker Porath: Radio-immuno-essai des protéines avec l’utilisation d’anticorps couplés par Sephadex. Dans: Biochim Biophys Acta (1966) 30: S. 257–260.
- ↑ E. Engvall, P. Perlman: Dosage immunosorbant lié à l’enzyme (ELISA). Dosage quantitatif de l’immunoglobuline G . Dans: Immunochimie . 8e année, Non. 9 , 1971, S. 871–874 , est ce que je: 10.1016 / 0019-2791 (71) 90454-X , PMID 5135623 .
- ↑ B. K. Van Weemen, A. H. Schuurs: Immunodosage utilisant des conjugués en antigène-enzyme . Dans: Lettres de FEB . 15e année, Non. 3 , 1971, S. 232–236 , est ce que je: 10.1016 / 0014-5793 (71) 80319-8 , PMID 11945853 .
- ↑ S. Leeng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuch: ELISA et Multiplex Technologies pour la mesure des cytokines dans la recherche sur l’inflammation et le vieillissement . Dans: J Gerontol A Biol Sci Med Sci . 63e année, Non. 8 , Octobre 2008, S. 879–884 , PMID 18772478 , PMC 2562869 (Texte complet gratuit).
- ↑ Dosage immunosorbant lié à l’enzyme (ELISA) (Ressourcen). Consulté le 12 mai 2018 .
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