Phasenkontrastmikroskopie – Wikipedia

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Optische Mikroskopie-Technik

Phasenkontrastmikroskopie ist eine optische Mikroskopietechnik, die Phasenverschiebungen des Lichts, das durch eine transparente Probe fällt, in Helligkeitsänderungen im Bild umwandelt. Phasenverschiebungen selbst sind unsichtbar, werden aber sichtbar, wenn sie als Helligkeitsschwankungen dargestellt werden.

Wenn sich Lichtwellen durch ein anderes Medium als ein Vakuum bewegen, bewirkt die Wechselwirkung mit dem Medium, dass sich die Wellenamplitude und -phase in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Mediums ändern. Amplitudenänderungen (Helligkeitsänderungen) entstehen durch Streuung und Absorption von Licht, das oft wellenlängenabhängig ist und zu Farben führen kann. Fotoapparate und das menschliche Auge sind nur auf Amplitudenschwankungen empfindlich. Ohne besondere Vorkehrungen sind Phasenänderungen daher unsichtbar. Phasenänderungen vermitteln jedoch oft wichtige Informationen.

Dieselben Zellen mit herkömmlicher Hellfeldmikroskopie (links) und mit Phasenkontrastmikroskopie (rechts)

Der Phasenkontrastmikroskopie kommt in der Biologie eine besondere Bedeutung zu. Es zeigt viele zelluläre Strukturen, die mit einem Hellfeldmikroskop unsichtbar sind, wie in der Abbildung veranschaulicht. Früheren Mikroskopikern wurden diese Strukturen durch Anfärben sichtbar gemacht, was jedoch eine zusätzliche Präparation und den Tod der Zellen erforderte. Das Phasenkontrastmikroskop ermöglichte es Biologen, lebende Zellen und ihre Vermehrung durch Zellteilung zu untersuchen. Es ist eine der wenigen verfügbaren Methoden zur Quantifizierung der Zellstruktur und -komponenten, die keine Fluoreszenz verwendet.[1]

Nach seiner Erfindung in den frühen 1930er Jahren[2] Die Phasenkontrastmikroskopie erwies sich als ein solcher Fortschritt in der Mikroskopie, dass ihr Erfinder Frits Zernike 1953 mit dem Nobelpreis für Physik ausgezeichnet wurde.[3]

Arbeitsprinzip[edit]

Funktionsprinzip der Dunkelfeld- und Phasenkontrastmikroskopie

Das Grundprinzip, um Phasenänderungen in der Phasenkontrastmikroskopie sichtbar zu machen, besteht darin, das Beleuchtungs-(Hintergrund-)Licht vom Probenstreulicht (das die Vordergrunddetails ausmacht) zu trennen und diese unterschiedlich zu manipulieren.

Das ringförmige Beleuchtungslicht (grün), das den Kondensorring passiert, wird vom Kondensor auf die Probe fokussiert. Ein Teil des Beleuchtungslichts wird von der Probe gestreut (gelb). Das restliche Licht wird von der Probe nicht beeinflusst und bildet das Hintergrundlicht (rot). Bei der Beobachtung einer ungefärbten biologischen Probe ist das Streulicht schwach und typischerweise um –90° phasenverschoben (aufgrund sowohl der typischen Dicke der Proben als auch des Brechungsindexunterschieds zwischen biologischem Gewebe und dem umgebenden Medium) relativ zum Hintergrundlicht. Dies führt dazu, dass Vordergrund (blauer Vektor) und Hintergrund (roter Vektor) nahezu die gleiche Intensität aufweisen, was zu einem geringen Bildkontrast führt.

In einem Phasenkontrastmikroskop wird der Bildkontrast auf zwei Arten erhöht: durch Erzeugung konstruktiver Interferenz zwischen Streu- und Hintergrundlichtstrahlen in Bereichen des Gesichtsfelds, die die Probe enthalten, und durch Reduzierung der Hintergrundlichtmenge, die die Bildebene erreicht . Zuerst wird das Hintergrundlicht um –90° phasenverschoben, indem es durch einen Phasenschieberring geleitet wird, wodurch die Phasendifferenz zwischen dem Hintergrund und den Streulichtstrahlen eliminiert wird.

Arbeitsprinzip der Phasenkontrastmikroskopie.gif

Wenn das Licht dann auf die Bildebene fokussiert wird (wo eine Kamera oder ein Okular platziert ist), führt diese Phasenverschiebung dazu, dass Hintergrund- und Streulichtstrahlen, die aus Bereichen des Gesichtsfelds stammen, die die Probe enthalten (dh den Vordergrund), konstruktiv interferieren , was zu einer Erhöhung der Helligkeit dieser Bereiche im Vergleich zu Bereichen führt, die die Probe nicht enthalten. Schließlich wird der Hintergrund durch einen Graufilterring ~70-90% gedimmt; dieses Verfahren maximiert die Menge an Streulicht, die durch das Beleuchtungs-(dh Hintergrund-)Licht erzeugt wird, während die Menge an Beleuchtungslicht, die die Bildebene erreicht, minimiert wird. Ein Teil des Streulichts, das die gesamte Oberfläche des Filters beleuchtet, wird durch die Ringe phasenverschoben und gedimmt, jedoch in viel geringerem Maße als das Hintergrundlicht, das nur die Phasenverschiebungs- und Graufilterringe beleuchtet.

Das obige beschreibt negativer Phasenkontrast. In seinem positiv wird das Hintergrundlicht stattdessen um +90° phasenverschoben. Das Hintergrundlicht ist somit relativ zum Streulicht um 180° phasenverschoben. Das Streulicht wird dann vom Hintergrundlicht subtrahiert, um ein Bild mit einem dunkleren Vordergrund und einem helleren Hintergrund zu erzeugen, wie in der ersten Abbildung gezeigt.[4][5][6]

Verwandte Methoden[edit]

Ein quantitatives Phasenkontrastmikroskopie-Bild von Zellen in Kultur. Höhe und Farbe eines Bildpunktes entsprechen der optischen Dicke, die nur von der Objektdicke und dem relativen Brechungsindex abhängt. Somit kann das Volumen eines Objekts bestimmt werden, wenn der Brechungsindexunterschied zwischen dem Objekt und den umgebenden Medien bekannt ist.

Der Erfolg des Phasenkontrastmikroskops hat zu einer Reihe von nachfolgenden Phasenabbildungsverfahren geführt. 1952 patentierte Georges Nomarski die heute als Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) bekannte Mikroskopie.[7]

Es erhöht den Kontrast, indem es künstliche Schatten erzeugt, als ob das Objekt von der Seite beleuchtet würde. Die DIC-Mikroskopie ist jedoch ungeeignet, wenn das Objekt oder sein Behälter die Polarisation ändern. Mit der zunehmenden Verwendung von polarisierenden Kunststoffbehältern in der Zellbiologie wird die DIC-Mikroskopie zunehmend durch die Hoffman-Modulationskontrastmikroskopie ersetzt, die 1975 von Robert Hoffman erfunden wurde.[8]

Herkömmliche Phasenkontrastverfahren verbessern den Kontrast optisch und mischen Helligkeits- und Phaseninformationen in einem einzigen Bild. Seit der Einführung der Digitalkamera Mitte der 1990er Jahre wurden mehrere neue digitale Phasenabbildungsverfahren entwickelt, die zusammenfassend als quantitative Phasenkontrastmikroskopie bekannt sind. Diese Methoden erzeugen digital zwei separate Bilder, ein gewöhnliches Hellfeldbild und ein sogenanntes Phasenverschiebungsbild. In jedem Bildpunkt zeigt das Phasenverschiebungsbild die quantifiziert durch das Objekt induzierte Phasenverschiebung, die proportional zur optischen Dicke des Objekts ist.[9]

Siehe auch[edit]

Verweise[edit]

  1. ^ “Das Phasenkontrastmikroskop”. Nobel Media AB.
  2. ^ Zernike, F. (1955). “Wie ich den Phasenkontrast entdeckte”. Wissenschaft. 121 (3141): 345–349. Bibcode:1955Sc…121..345Z. mach:10.1126/science.121.3141.345. PMID 13237991.
  3. ^ “Der Nobelpreis für Physik 1953”. Nobel Media AB.
  4. ^ Frits Zernike (1942). “Phasenkontrast, eine neue Methode zur mikroskopischen Beobachtung transparenter Objekte Teil I”. Physik. 9 (7): 686–698. Bibcode:1942Phy…..9..686Z. mach:10.1016/S0031-8914(42)80035-X.
  5. ^ Frits Zernike (1942). “Phasenkontrast, eine neue Methode zur mikroskopischen Beobachtung transparenter Objekte Teil II”. Physik. 9 (10): 974–980. Bibcode:1942Phy…..9..974Z. mach:10.1016/S0031-8914(42)80079-8.
  6. ^ Oscar Richards (1956). “Phasenmikroskopie 1954-56”. Wissenschaft. 124 (3226): 810–814. Bibcode:1956Sc…124..810R. mach:10.1126/science.124.3226.810.
  7. ^ US2924142, Georges Nomarski, “INTERFERENTIELLES POLARISIERGERÄT ZUR UNTERSUCHUNG VON PHASENOBJEKTEN”
  8. ^ US4200354, Robert Hoffman, “Mikroskopiesysteme mit rechteckiger Beleuchtung, die besonders für die Betrachtung transparenter Objekte geeignet sind”
  9. ^ Kemmler, M.; Fratz, M.; Giel, D.; Saum, N.; Brandenburg, A.; Hoffmann, C. (2007). „Nichtinvasive zeitabhängige Zytometrieüberwachung durch digitale Holographie“. Zeitschrift für biomedizinische Optik. 12 (6): 064002. Bibcode:2007JBO….12f4002K. mach:10.1117/1.2804926. PMID 18163818.

Externe Links[edit]


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