Einzelpartikelanalyse – Wikipedia

Posted on by
before-content-x4

Die Einzelpartikelanalyse segmentiert und mittelt viele Partikel aus einer Probe, sodass Computeralgorithmen die einzelnen Bilder zu einem kombinierten “repräsentativen” Bild verarbeiten können. Dies ermöglicht Verbesserungen des Signal-Rausch-Verhältnisses und kann mit der Entfaltung kombiniert werden, um begrenzte Verbesserungen der räumlichen Auflösung im Bild bereitzustellen.

Einzelpartikelanalyse ist eine Gruppe verwandter computergestützter Bildverarbeitungstechniken, die zur Analyse von Bildern aus der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden.[1] Diese Methoden wurden entwickelt, um die Informationen zu verbessern und zu erweitern, die aus TEM-Bildern von Partikelproben, typischerweise Proteinen oder anderen großen biologischen Einheiten wie Viren, erhalten werden können. Einzelne Bilder von gefärbten oder nicht gefärbten Partikeln sind sehr verrauscht und daher schwer zu interpretieren. Die Kombination mehrerer digitalisierter Bilder ähnlicher Partikel ergibt ein Bild mit stärkeren und leichter interpretierbaren Merkmalen. Eine Erweiterung dieser Technik verwendet Einzelpartikelmethoden, um eine dreidimensionale Rekonstruktion des Partikels aufzubauen. Mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie ist es möglich geworden, Rekonstruktionen mit einer Auflösung im Subnanometerbereich und einer Auflösung nahe dem Atom zu erzeugen[2][3] zuerst bei hochsymmetrischen Viren und jetzt auch bei kleineren asymmetrischen Proteinen.[4]

Techniken[edit]

Die Einzelpartikelanalyse kann sowohl an negativ gefärbten als auch in in Glaskörpereis eingebetteten CryoTEM-Proben durchgeführt werden. Einzelpartikelanalyseverfahren hängen im Allgemeinen davon ab, dass die Probe homogen ist, obwohl Techniken für den Umgang damit Konformationsheterogenität Werden entwickelt.

Bilder (mikroskopische Aufnahmen), die in der Vergangenheit auf Film gesammelt wurden, werden mit hochwertigen Scannern oder mit eingebauten CCD-Detektoren digitalisiert, die an eine phosphoreszierende Schicht gekoppelt sind. Heutzutage ist es üblich, direkte Elektronendetektoren zum Sammeln von Bildern zu verwenden. Die Bildverarbeitung erfolgt beispielsweise mit speziellen Softwareprogrammen[5]), häufig auf Computerclustern mit mehreren Prozessoren ausgeführt. Abhängig von der Probe oder den gewünschten Ergebnissen können verschiedene Schritte der zwei- oder dreidimensionalen Verarbeitung durchgeführt werden.

Ausrichtung und Klassifizierung[edit]

Biologische Proben und insbesondere in dünnes Glaskörpereis eingebettete Proben sind hoch strahlungsempfindlich, so dass nur niedrige Elektronendosen zur Abbildung der Probe verwendet werden können. Diese niedrige Dosis sowie Variationen in der Metallfleck verwendet (falls verwendet) bedeutet, dass Bilder im Verhältnis zu dem von dem beobachteten Partikel gegebenen Signal ein hohes Rauschen aufweisen. Durch Ausrichten mehrerer ähnlicher Bilder zueinander im Register und anschließendes Mitteln kann ein Bild mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis erhalten werden. Da das Rauschen meist zufällig verteilt ist und die zugrunde liegenden Bildmerkmale konstant sind, werden durch Mitteln der Intensität jedes Pixels über mehrere Bilder nur die konstanten Merkmale verstärkt. Typischerweise wird die optimale Ausrichtung (eine Verschiebung und eine Drehung in der Ebene) zum Abbilden eines Bildes auf ein anderes durch Kreuzkorrelation berechnet.

Eine mikroskopische Aufnahme enthält jedoch häufig Partikel in mehreren unterschiedlichen Orientierungen und / oder Konformationen. Um repräsentativere Bildmittelwerte zu erhalten, ist ein Verfahren erforderlich, um ähnliche Partikelbilder zu mehreren Sätzen zusammenzufassen. Dies wird normalerweise unter Verwendung eines von mehreren Datenanalyse- und Bildklassifizierungsalgorithmen durchgeführt, wie beispielsweise einer mehrvariablen statistischen Analyse und einer hierarchischen Aszendentenklassifizierung, oder k-mittel Clustering.

Oft werden Datensätze von Zehntausenden von Partikelbildern verwendet, und um eine optimale Lösung zu erreichen, wird ein iteratives Verfahren zur Ausrichtung und Klassifizierung verwendet, wobei starke Bildmittelwerte, die durch Klassifizierung erzeugt werden, als Referenzbilder für eine nachfolgende Ausrichtung des gesamten Datensatzes verwendet werden .

Bildfilterung[edit]

Die Bildfilterung (Bandpassfilterung) wird häufig verwendet, um den Einfluss von Informationen mit hoher und / oder niedriger Ortsfrequenz in den Bildern zu verringern, was die Ergebnisse der Ausrichtungs- und Klassifizierungsverfahren beeinflussen kann. Dies ist besonders nützlich bei negativen Fleckenbildern. Die Algorithmen verwenden schnelle Fourier-Transformationen (FFT), bei denen häufig Gauß-förmige Weichkantenmasken im Reziprokraum verwendet werden, um bestimmte Frequenzbereiche zu unterdrücken. Hochpassfilter entfernen niedrige Ortsfrequenzen (wie Rampen- oder Gradienteneffekte) und lassen die höheren Frequenzen intakt. Tiefpassfilter entfernen Merkmale mit hoher Ortsfrequenz und verwischen feine Details.

Kontrastübertragungsfunktion[edit]

Aufgrund der Art der Bilderzeugung im Elektronenmikroskop werden Hellfeld-TEM-Bilder unter Verwendung eines signifikanten Unterfokus erhalten. Dies führt zusammen mit den Merkmalen, die dem Linsensystem des Mikroskops eigen sind, zu einer Unschärfe der gesammelten Bilder, die als Punktstreufunktion sichtbar sind. Die kombinierten Effekte der Bildgebungsbedingungen sind als Kontrastübertragungsfunktion (CTF) bekannt und können als Funktion im reziproken Raum mathematisch angenähert werden. Spezielle Bildverarbeitungstechniken wie Phasenumkehr und Amplitudenkorrektur / Wiener Filterung können (zumindest teilweise)[6]) korrigieren Sie die CTF und ermöglichen Sie hochauflösende Rekonstruktionen.

Dreidimensionale Rekonstruktion[edit]

Transmissionselektronenmikroskopische Bilder sind Projektionen des Objekts, die die Verteilung der Dichte durch das Objekt zeigen, ähnlich wie bei medizinischen Röntgenstrahlen. Unter Verwendung des Projektionsscheibensatzes kann eine dreidimensionale Rekonstruktion des Objekts erzeugt werden, indem viele Bilder (2D-Projektionen) des Objekts aus einem Blickwinkelbereich kombiniert werden. Proteine ​​in Glaskörpereis nehmen idealerweise eine zufällige Verteilung der Orientierungen (oder Betrachtungswinkel) an und ermöglichen eine ziemlich isotrope Rekonstruktion, wenn eine große Anzahl von Partikelbildern verwendet wird. Dies steht im Gegensatz zur Elektronentomographie, bei der die Betrachtungswinkel aufgrund der Geometrie der Probe / Bildgebung begrenzt sind, was eine anisotrope Rekonstruktion ergibt. Die gefilterte Rückprojektion ist eine häufig verwendete Methode zur Erzeugung von 3D-Rekonstruktionen in der Einzelpartikelanalyse, obwohl viele alternative Algorithmen existieren.[3]

Bevor eine Rekonstruktion durchgeführt werden kann, muss die Ausrichtung des Objekts in jedem Bild geschätzt werden. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die relativen Euler-Winkel jedes Bildes zu ermitteln. Einige basieren auf gemeinsamen Linien (gemeinsame 1D-Projektionen und Sinogramme), andere verwenden iterative Projektionsanpassungsalgorithmen. Letzteres beginnt mit einem einfachen 3D-Startmodell mit niedriger Auflösung, vergleicht die experimentellen Bilder mit Projektionen des Modells und erstellt ein neues 3D, um eine Lösung zu finden.

Es stehen auch Methoden zur Verfügung, um 3D-Rekonstruktionen von helikalen Proben (wie dem Tabakmosaikvirus) durchzuführen, wobei die inhärente helikale Symmetrie ausgenutzt wird. Für diese Proben können sowohl Realraummethoden (Behandlung von Abschnitten der Helix als einzelne Partikel) als auch reziproke Raummethoden (unter Verwendung von Beugungsmustern) verwendet werden.

Neigungsmethoden[edit]

Der Probentisch des Mikroskops kann gekippt werden (typischerweise entlang einer einzelnen Achse), wodurch die als Einzelpartikeltechnik bekannte Technik ermöglicht wird zufällige konische Neigung.[7] Ein Bereich der Probe wird sowohl bei Null- als auch bei Neigungen mit hohem Winkel (~ 60-70 Grad) oder im Fall der verwandten Methode von abgebildet orthogonale Neigungsrekonstruktion, +45 und –45 Grad. Partikelpaare, die demselben Objekt bei zwei verschiedenen Neigungen (Neigungspaaren) entsprechen, werden ausgewählt, und durch Befolgen der in nachfolgenden Ausrichtungs- und Klassifizierungsschritten verwendeten Parameter kann relativ einfach eine dreidimensionale Rekonstruktion erzeugt werden. Dies liegt daran, dass der Betrachtungswinkel (definiert als drei Euler-Winkel) jedes Partikels aus der Neigungsgeometrie bekannt ist.

3D-Rekonstruktionen aus zufälliger konischer Neigung leiden unter fehlenden Informationen, die sich aus einem eingeschränkten Orientierungsbereich ergeben. Bekannt als der fehlende Kegel (aufgrund der Form im wechselseitigen Raum) führt dies zu Verzerrungen in den 3D-Karten. Das Problem des fehlenden Kegels kann jedoch häufig durch Kombinieren mehrerer Neigungsrekonstruktionen überwunden werden. Tilt-Verfahren eignen sich am besten für negativ gefärbte Proben und können für Partikel verwendet werden, die in bevorzugten Orientierungen am Kohlenstoffträgerfilm adsorbieren. Das als Laden bekannte Phänomen oder strahlinduzierte Bewegung macht das Sammeln von Bildern mit hoher Neigung von Proben in Glaskörpereis schwierig.

Kartenvisualisierung und -anpassung[edit]

Es stehen verschiedene Softwareprogramme zur Verfügung, mit denen die 3D-Karten angezeigt werden können. Diese ermöglichen es dem Benutzer häufig, Proteinkoordinaten (Strukturen aus der Röntgenkristallographie oder NMR) von Untereinheiten manuell in die Elektronendichte einzudocken. Mehrere Programme können auch rechnerisch Untereinheiten anpassen.

Beispiele[edit]

  • Wichtige Informationen zur Proteinsynthese, Ligandenbindung und RNA-Wechselwirkung können mit dieser neuen Technik bei mittleren Auflösungen von 7,5 bis 25 Å erhalten werden.[8]
  • Methanococcus maripaludis Chaperonin,[9] rekonstruiert auf 0,43 Nanometer Auflösung.[10] Dieser bakterielle Proteinkomplex ist eine Maschine zum Falten anderer Proteine, die in der Schale eingeschlossen werden.
  • Fettsäuresynthase[11] aus Hefe mit einer Auflösung von 0,59 Nanometer.[12] Dieser riesige Enzymkomplex ist verantwortlich für den Aufbau der langkettigen Fettsäuren, die für das Zellleben essentiell sind.
  • Eine 0,33-Nanometer-Rekonstruktion des Aquareovirus.[13][14] Diese Viren infizieren Fische und andere Wassertiere. Die Rekonstruktion hat eine ausreichend hohe Auflösung, um Aminosäureseitenkettendichten leicht sichtbar zu machen.

Primärdatenbank[edit]

Verweise[edit]

  1. ^ Frank, Joachim (2006). Dreidimensionale Elektronenmikroskopie makromolekularer Anordnungen: Visualisierung biologischer Moleküle in ihrem nativen Zustand. Oxford: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-518218-7.[page needed]
  2. ^ Zhou ZH (April 2008). “Auf dem Weg zur atomaren Auflösung der Strukturbestimmung durch Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie”. Aktuelle Meinung in der Strukturbiologie. 18 (2): 218–28. doi:10.1016 / j.sbi.2008.03.004. PMC 2714865. PMID 18403197.
  3. ^ ein b Wang Q, Matsui T., Domitrovic T., Zheng Y., Doerschuk PC, Johnson JE (März 2013). “Dynamik in Kryo-EM-Rekonstruktionen, die mit Varianzkarten mit maximaler Wahrscheinlichkeit visualisiert wurden”. Zeitschrift für Strukturbiologie. 181 (3): 195–206. doi:10.1016 / j.jsb.2012.11.005. PMC 3870017. PMID 23246781.
  4. ^ Bartesaghi, Alberto; Merk, Alan; Banerjee, Soojay; Matthies, Doreen; Wu, Xiongwu; Milne, Jacqueline LS; Subramaniam, Sriram (05.06.2015). CryoTEM-Struktur von β-Galactosidase mit einer Auflösung von 2,2 Å im Komplex mit einem zellpermeanten Inhibitor. Wissenschaft. 348 (6239): 1147–1151. Bibcode:2015Sci … 348.1147B. doi:10.1126 / science.aab1576. ISSN 1095-9203. PMC 6512338. PMID 25953817.
  5. ^ “金 彩 金 38 满 100 提 现 _ 无需 申请 自动 送 彩 金 【官 网】”.
  6. ^ Downing KH, Glaeser RM (August 2008). “Wiederherstellung von Bildern mit schwachem Phasenkontrast, die mit einem hohen Grad an Defokussierung aufgenommen wurden: das mit der CTF-Korrektur verbundene” Doppelbild “-Problem”. Ultramikroskopie. 108 (9): 921–8. doi:10.1016 / j.ultramic.2008.03.004. PMC 2694513. PMID 18508199.
  7. ^ Radermacher M., Wagenknecht T., Verschoor A., ​​Frank J. (Mai 1987). “Dreidimensionale Rekonstruktion aus einer zufälligen konischen Neigungsreihe mit Einzelbelichtung, angewendet auf die 50S-ribosomale Untereinheit von Escherichia coli”. Journal of Microscopy. 146 (Pt 2): 113–36. doi:10.1111 / j.1365-2818.1987.tb01333.x. PMID 3302267.
  8. ^ Arias-Palomo E, MA Recuero-Checa, XR Bustelo, O Llorca (Dezember 2007). “3D-Struktur der Syk-Kinase bestimmt durch Einzelteilchen-Elektronenmikroskopie”. Biochim. Biophys. Acta. 1774 (12): 1493–9. doi:10.1016 / j.bbapap.2007.10.008. PMC 2186377. PMID 18021750.
  9. ^ Japanische Proteindatenbank http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5137
  10. ^ Zhang J., Baker ML, Schröder GF, et al. (Januar 2010). “Mechanismus des Schließens der Faltkammer in einem Chaperonin der Gruppe II”. Natur. 463 (7279): 379–83. Bibcode:2010Natur.463..379Z. doi:10.1038 / nature08701. PMC 2834796. PMID 20090755.
  11. ^ Japanische Proteindatenbank http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=1623
  12. ^ Gipson P., Mills DJ, Wouts R., Grininger M., Vonck J., Kühlbrandt W. (Mai 2010). “Direkter struktureller Einblick in den Substrat-Shuttling-Mechanismus der Hefefettsäuresynthase durch Elektronenkryomikroskopie”. Verfahren der National Academy of Sciences der Vereinigten Staaten von Amerika. 107 (20): 9164–9. Bibcode:2010PNAS..107.9164G. doi:10.1073 / pnas.0913547107. PMC 2889056. PMID 20231485.
  13. ^ Japanische Proteindatenbank http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5160
  14. ^ Zhang X, Jin L, Fang Q, Hui WH, Zhou ZH (April 2010). “3.3 Eine Kryo-EM-Struktur eines nicht umhüllten Virus zeigt einen Priming-Mechanismus für den Zelleintritt.”. Zelle. 141 (3): 472–82. doi:10.1016 / j.cell.2010.03.041. PMC 3422562. PMID 20398923.

Externe Links[edit]

after-content-x4