Zellstörung – Wikipedia

Zellstörung ist eine Methode oder ein Verfahren zur Freisetzung biologischer Moleküle aus dem Inneren einer Zelle.

Methoden[edit]

Die Herstellung biologisch interessanter Moleküle unter Verwendung von Klonierungs- und Kultivierungsmethoden ermöglicht die Untersuchung und Herstellung relevanter Moleküle. Mit Ausnahme von ausgeschiedenen Molekülen müssen Zellen, die interessierende Moleküle produzieren, zerstört werden. Diese Seite beschreibt verschiedene Methoden. Eine andere Methode der Störung ist das Entdachen von Zellen.

Perlenmethode[edit]

Ein übliches mechanisches Verfahren im Labormaßstab zum Aufbrechen von Zellen verwendet Glas-, Keramik- oder Stahlperlen mit einem Durchmesser von 0,1 bis 2 mm, die mit einer in wässrigen Medien suspendierten Probe gemischt werden. Die von Tim Hopkins Ende der 1970er Jahre erstmals entwickelte Mischung aus Probe und Perle wird durch Rühren oder Schütteln stark gerührt. Perlen kollidieren mit der Zellprobe und öffnen die Zelle, um interzelluläre Komponenten freizusetzen. Im Gegensatz zu einigen anderen Methoden ist die mechanische Scherung während der Homogenisierung moderat, was zu hervorragenden Membran- oder subzellulären Präparaten führt. Die Methode, die oft als “Perlenschlagen” bezeichnet wird, eignet sich für alle Arten von Zellmaterial – von Sporen bis hin zu tierischen und pflanzlichen Geweben. Es ist die am weitesten verbreitete Methode der Hefelyse und kann zu einem Bruch von weit über 50% (bis zu 95%) führen.^[1] Es hat gegenüber anderen Methoden zum Aufbrechen mechanischer Zellen den Vorteil, dass es in der Lage ist, sehr kleine Probengrößen aufzubrechen, viele Proben gleichzeitig ohne Bedenken hinsichtlich einer Kreuzkontamination zu verarbeiten und dabei keine potenziell schädlichen Aerosole freizusetzen.

Im einfachsten Beispiel des Verfahrens wird einer Zell- oder Gewebesuspension in einem Reagenzglas ein gleiches Volumen an Kügelchen zugesetzt, und die Probe wird auf einem herkömmlichen Laborwirbelmischer kräftig gemischt. Während die Verarbeitungszeiten langsam sind und 3 bis 10 Mal länger dauern als bei Spezialschüttelmaschinen, eignet es sich gut für leicht zerstörbare Zellen und ist kostengünstig.

Erfolgreiches Perlenschlagen hängt nicht nur von den Konstruktionsmerkmalen der Schüttelmaschine ab (die Schüttelschwingungen pro Minute, Schüttelwurf oder -abstand, Schüttelorientierung und Fläschchenorientierung berücksichtigen), sondern auch von der Auswahl der richtigen Perlengröße (0,1–6 mm Durchmesser). Perlenzusammensetzung (Glas, Keramik, Stahl) und Perlenbeladung in der Durchstechflasche.

In den meisten Labors wird das Perlenschlagen in Chargengrößen von ein bis vierundzwanzig versiegelten Kunststoffflaschen oder Zentrifugenröhrchen durchgeführt. Die Probe und die winzigen Perlen werden in speziell entwickelten Hubkolbenschüttlern, die von Hochleistungselektromotoren angetrieben werden, mit etwa 2000 Schwingungen pro Minute bewegt. Die Zellzerstörung ist nach 1–3 Minuten Schütteln abgeschlossen. Mit einer Beadbeater-Variante namens SoniBeast werden signifikant schnellere Zellaufschlussraten erzielt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Maschinen werden die Perlen mit einer Wirbelbewegung von 20.000 oscl / min bewegt. Größere Beadbeater-Maschinen, die Mikrotiterplatten mit tiefen Vertiefungen enthalten, verkürzen auch die Prozesszeiten, ebenso wie Perlenspender, mit denen Perlen schnell in mehrere Fläschchen oder Mikrotiterplatten geladen werden können.^[2][3] Vorinstallierte Fläschchen und Mikrotiterplatten sind ebenfalls erhältlich.

Alle Hochenergie-Perlenschlagmaschinen erwärmen die Probe um etwa 10 Grad / Minute. Dies ist auf Reibungskollisionen der Perlen während der Homogenisierung zurückzuführen. Das Abkühlen der Probe während oder nach dem Perlenschlagen kann erforderlich sein, um eine Schädigung wärmeempfindlicher Proteine ​​wie Enzyme zu verhindern. Die Erwärmung der Probe kann durch kurzes Perlenschlagen mit Abkühlen auf Eis zwischen den einzelnen Intervallen, durch Verarbeiten von Fläschchen in vorgekühlten Aluminiumfläschchenhaltern oder durch Zirkulieren von gasförmigem Kühlmittel durch die Maschine während des Perlenschlags gesteuert werden.

Eine andere Perlenschlägerkonfiguration, die für größere Probenvolumina geeignet ist, verwendet einen rotierenden Fluorkohlenwasserstoffrotor in einer Kammer von 15, 50 oder 200 ml, um die Perlen zu bewegen. In dieser Konfiguration kann die Kammer von einem statischen Kühlmantel umgeben sein. Unter Verwendung derselben Rotor / Kammer-Konfiguration stehen große kommerzielle Maschinen zur Verfügung, um viele Liter Zellsuspension zu verarbeiten. Gegenwärtig sind diese Maschinen auf die Verarbeitung einzelliger Organismen wie Hefe, Algen und Bakterien beschränkt.

Kryopulverisierung[edit]

Proben mit einer zähen extrazellulären Matrix wie tierisches Bindegewebe, einige Tumorbiopsieproben, venöses Gewebe, Knorpel, Samen usw. werden durch Schlagpulverisierung bei Temperaturen von flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver reduziert. Diese als Kryopulverisierung bekannte Technik basiert auf der Tatsache, dass biologische Proben, die einen signifikanten Anteil an Wasser enthalten, bei extrem kalten Temperaturen spröde werden. Diese Technik wurde erstmals 1975 von Smucker und Pfister beschrieben, die die Technik als Kryo-Impacting bezeichneten. Die Autoren zeigten, dass Zellen durch diese Methode effektiv gebrochen werden, und bestätigten durch Phasen- und Elektronenmikroskopie, dass Bruchebenen Zellwände und zytoplasmatische Membranen kreuzen.^[4]

Die Technik kann unter Verwendung eines Mörsers und eines Stößels durchgeführt werden, die auf Temperaturen von flüssigem Stickstoff abgekühlt sind. Die Verwendung dieser klassischen Vorrichtung ist jedoch mühsam und der Probenverlust ist häufig ein Problem. Zu diesem Zweck sind auch spezielle Edelstahlpulverisierer erhältlich, die allgemein als Gewebepulverisierer bekannt sind. Sie erfordern weniger manuellen Aufwand, bieten eine gute Probenrückgewinnung und sind zwischen den Proben leicht zu reinigen. Vorteile dieser Technik sind höhere Ausbeuten an Proteinen und Nukleinsäuren aus kleinen Hartgewebeproben – insbesondere wenn sie als Vorstufe zu den oben erwähnten mechanischen oder chemischen / lösungsmittelhaltigen Zellaufschlussverfahren verwendet werden.

Störung der Hochdruckzelle[edit]

Seit den 1940er Jahren wird Hochdruck als Methode zur Zellzerstörung eingesetzt, insbesondere von der French Pressure Cell Press, kurz French Press. Diese Methode wurde von Charles Stacy French entwickelt und verwendet hohen Druck, um Zellen durch eine enge Öffnung zu drücken, wodurch die Zellen aufgrund der Scherkräfte, die über die Druckdifferenz erfahren werden, lysieren.^[5][6] Während französische Pressen in vielen mikrobiologischen Labors zu einem Grundnahrungsmittel geworden sind, wurde ihre Produktion weitgehend eingestellt, was zu einer Wiederbelebung alternativer Anwendungen ähnlicher Technologien führte.

Moderne physikalische Zellstörer arbeiten typischerweise entweder über pneumatischen oder hydraulischen Druck. Obwohl pneumatische Maschinen typischerweise kostengünstiger sind, kann ihre Leistung aufgrund von Schwankungen des Verarbeitungsdrucks während des Hubs der Luftpumpe unzuverlässig sein. Es wird allgemein angenommen, dass hydraulische Maschinen aufgrund ihrer Fähigkeit, den Druck während des gesamten Kolbenhubs konstant zu halten, eine überlegene Lysierfähigkeit bieten, insbesondere wenn schwer zu brechende Proben wie Hefe oder grampositive Bakterien verarbeitet werden. Da die French Press, die mit Hydraulikdruck betrieben wird, über 90% der am häufigsten verwendeten Zelltypen lysieren kann, wird sie häufig als Goldstandard für die Lyse-Leistung angesehen, und moderne Maschinen werden häufig nicht nur hinsichtlich der Lyse mit ihr verglichen Effizienz, aber auch in Bezug auf Sicherheit und Benutzerfreundlichkeit. Einige Hersteller versuchen auch, das traditionelle Design zu verbessern, indem sie andere Eigenschaften in diesen Maschinen als den Druck ändern, der die Probe durch die Öffnung treibt. Ein solches Beispiel ist Constant Systems, die kürzlich gezeigt haben, dass ihre Cell Disruptors nicht nur der Leistung einer traditionellen französischen Presse entsprechen, sondern auch danach streben, die gleichen Ergebnisse bei einer viel geringeren Leistung zu erzielen.^[7]

Druckkreislauftechnologie (“PCT”). PCT ist eine patentierte Technologieplattform, die abwechselnde hydrostatische Druckzyklen zwischen Umgebungs- und ultrahohen Werten (bis zu 90.000 psi) verwendet, um die Wirkung von Molekülen in biologischen Proben, z. B. den Bruch (Lyse), sicher, bequem und reproduzierbar zu steuern. von Zellen und Geweben aus menschlichen, tierischen, pflanzlichen und mikrobiellen Quellen sowie die Inaktivierung von Krankheitserregern. PCT-verbesserte Systeme (Instrumente und Verbrauchsmaterialien) lösen einige herausfordernde Probleme bei der biologischen Probenvorbereitung. Zu den PCT-Vorteilen gehören: (a) Extraktion und Gewinnung von mehr Membranproteinen, (b) verstärkter Proteinverdau, (c) differentielle Lyse in einer gemischten Probenbasis, (d) Inaktivierung von Pathogenen, (e) verstärkter DNA-Nachweis und (f) exquisite Kontrolle des Probenvorbereitungsprozesses.^[8]

Das zur Zellzerstörung verwendete Mikrofluidisierungsverfahren beeinflusst stark die physikochemischen Eigenschaften der lysierten Zellsuspension, wie Partikelgröße, Viskosität, Proteinausbeute und Enzymaktivität. In den letzten Jahren hat das Mikrofluidisierungsverfahren aufgrund seiner einfachen Verwendung und Effizienz beim Aufbrechen vieler verschiedener Zelltypen an Popularität beim Aufbrechen von Zellen gewonnen. Die Mikrofluidisierungstechnologie wurde von einem Unternehmen namens Arthur D. Little lizenziert und erstmals in den 1980er Jahren entwickelt und eingesetzt, zunächst als Werkzeug für die Liposomenbildung. Es wurde seitdem unter anderem in anderen Anwendungen wie Nanoemulsionen zum Aufbrechen von Zellen und zur Verringerung der Partikelgröße verwendet.

Durch die Verwendung von Mikrokanälen mit fester Geometrie und einer Verstärkerpumpe werden hohe Schergeschwindigkeiten erzeugt, die die Zellen aufbrechen. Diese Methode der Zelllyse kann zum Bruch von über 90% der E. coli-Zellen führen.^[9]

Viele Proteine ​​sind extrem temperaturempfindlich und können in vielen Fällen bereits bei Temperaturen von 4 Grad Celsius zu denaturieren beginnen. Innerhalb der Mikrokanäle überschreiten die Temperaturen 4 Grad Celsius, aber die Maschine ist so ausgelegt, dass sie schnell abkühlt, so dass die Zeit, in der die Zellen erhöhten Temperaturen ausgesetzt sind, extrem kurz ist (Verweilzeit 25 ms-40 ms). Aufgrund dieser effektiven Temperaturkontrolle liefert der Mikrofluidisierer höhere Mengen an aktiven Proteinen und Enzymen als andere mechanische Verfahren, wenn die Proteine ​​temperaturempfindlich sind.^[10]

Viskositätsänderungen werden auch häufig beim Aufbrechen von Zellen beobachtet. Wenn die Viskosität der Zellsuspension hoch ist, kann dies die nachgeschaltete Handhabung – wie Filtration und genaues Pipettieren – ziemlich schwierig machen. Die mit einem Mikrofluidisierer beobachteten Viskositätsänderungen sind relativ gering und nehmen mit weiteren zusätzlichen Durchgängen durch die Maschine ab.^[11]

Im Gegensatz zu anderen mechanischen Aufbrechverfahren bricht der Mikrofluidisierer die Zellmembranen effizient, aber sanft, was zu relativ großen Zellwandfragmenten (450 nm) führt und somit die Trennung des Zellinhalts erleichtert. Dies kann zu kürzeren Filtrationszeiten und einer besseren Zentrifugationstrennung führen.^[12]

Die Mikrofluidisierungstechnologie lässt sich von einem Milliliter auf Tausende von Litern skalieren.

Stickstoffdekompression[edit]

Zur Stickstoffdekompression werden zunächst große Mengen Stickstoff in der Zelle unter hohem Druck in einem geeigneten Druckbehälter gelöst. Wenn dann der Gasdruck plötzlich abgelassen wird, tritt der Stickstoff als expandierende Blasen aus der Lösung aus, die die Membranen jeder Zelle dehnen, bis sie platzen und den Inhalt der Zelle freisetzen.

Die Stickstoffdekompression schützt Enzyme und Organellen besser als Ultraschall- und mechanische Homogenisierungsverfahren und ist im Vergleich zu der kontrollierten Störwirkung, die in einem PTFE- und Glasmörser- und Stößelhomogenisator erhalten wird, günstig.^[13] Während andere störende Methoden von Reibung oder einer mechanischen Scherwirkung abhängen, die Wärme erzeugt, wird das Stickstoffdekompressionsverfahren von einer adiabatischen Expansion begleitet, die die Probe abkühlt, anstatt sie zu erhitzen.

Die Decke aus inertem Stickstoffgas, die die Zellsuspension und das Homogenisat sättigt, bietet Schutz gegen Oxidation von Zellbestandteilen. Obwohl bei dieser Technik andere Gase verwendet wurden: Kohlendioxid, Lachgas, Kohlenmonoxid und Druckluft, wird Stickstoff wegen seiner nicht reaktiven Natur und weil er den pH-Wert des Suspendiermediums nicht verändert, bevorzugt. Darüber hinaus wird Stickstoff bevorzugt, da er im Allgemeinen zu geringen Kosten und bei für dieses Verfahren geeigneten Drücken erhältlich ist.

Nach der Freisetzung sind subzelluläre Substanzen keinem fortgesetzten Abrieb ausgesetzt, der die Probe denaturieren oder unerwünschte Schäden verursachen könnte. Es besteht keine Notwendigkeit, auf einen Peak zwischen Enzymaktivität und prozentualer Störung zu achten. Da in jeder Zelle Stickstoffblasen erzeugt werden, wird die gleiche Störkraft gleichmäßig auf die Probe ausgeübt, wodurch eine ungewöhnliche Gleichmäßigkeit des Produkts sichergestellt wird. Es können zellfreie Homogenate hergestellt werden.

Die Technik wird verwendet, um Zellen und Gewebe zu homogenisieren, intakte Organellen freizusetzen, Zellmembranen herzustellen, labile Biochemikalien freizusetzen und einheitliche und wiederholbare Homogenate herzustellen, ohne die Probe extremen chemischen oder physikalischen Belastungen auszusetzen.

Das Verfahren eignet sich besonders gut zur Behandlung von Säugetier- und anderen membrangebundenen Zellen.^[14] Es wurde auch erfolgreich zur Behandlung von Pflanzenzellen, zur Freisetzung von Viren aus befruchteten Eiern und zur Behandlung fragiler Bakterien eingesetzt. Es wird nicht für unbehandelte Bakterienzellen empfohlen. Hefe, Pilz, Sporen und andere Materialien mit zähen Zellwänden sprechen auf diese Methode nicht gut an.

Siehe auch[edit]

Verweise[edit]