Kryogene Elektronenmikroskopie – Wikipedia

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Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (cryoTEM) einer intakten ARMAN-Zelle aus einem Iron Mountain-Biofilm. Die Bildbreite beträgt 576 nm.

Kryo-Elektronenmikroskopische Aufnahme des CroV-Riesen-Meeresvirus
(Maßstabsbalken steht für 200 nm)[1]

Kryogene Elektronenmikroskopie ((Kryo-EM) ist eine Elektronenmikroskopie (EM) -Technik, die auf Proben angewendet wird, die auf kryogene Temperaturen abgekühlt und in eine Umgebung aus glasartigem Wasser eingebettet sind. Eine wässrige Probenlösung wird auf ein Gitternetz aufgetragen und in flüssigem Ethan oder einer Mischung aus flüssigem Ethan und Propan getaucht.[2] Während die Entwicklung der Technik in den 1970er Jahren begann, ermöglichten die jüngsten Fortschritte in der Detektortechnologie und in Softwarealgorithmen die Bestimmung biomolekularer Strukturen bei nahezu atomarer Auflösung.[3] Dies hat große Aufmerksamkeit auf den Ansatz als Alternative zur Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie zur Bestimmung der makromolekularen Struktur ohne Notwendigkeit einer Kristallisation gelenkt.

Im Jahr 2017 wurde Jacques Dubochet, Joachim Frank und Richard Henderson der Nobelpreis für Chemie verliehen, “für die Entwicklung der Kryo-Elektronenmikroskopie zur hochauflösenden Strukturbestimmung von Biomolekülen in Lösung”.[4]Naturmethoden Kryo-EM 2016 auch als “Methode des Jahres” ausgezeichnet.[5]

Transmissionselektronen-Kryomikroskopie[edit]

Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine Transmissionselektronenmikroskopietechnik, die in der Strukturbiologie und in den Materialwissenschaften eingesetzt wird.

Geschichte[edit]

Frühe Entwicklung[edit]

In den 1960er Jahren war die Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie zur Strukturbestimmung aufgrund der Strahlenschäden durch hochenergetische Elektronenstrahlen begrenzt. Wissenschaftler stellten die Hypothese auf, dass die Untersuchung von Proben bei niedrigen Temperaturen die durch Strahlen verursachten Strahlenschäden verringern würde.[11] Sowohl flüssiges Helium (–269 ° C oder 4 K oder –452,2 ° F) als auch flüssiger Stickstoff (–195,79 ° C oder 77 K oder –320 ° F) wurden als Kryogene angesehen. 1980 veröffentlichten Erwin Knapek und Jacques Dubochet einen Kommentar zur Strahlschädigung bei kryogenen Temperaturen, in dem sie folgende Beobachtungen teilten:

Es wurde festgestellt, dass dünne Kristalle, die auf einem Kohlenstofffilm montiert sind, bei 4 K 30- bis 300-mal strahlbeständiger sind als bei Raumtemperatur … Die meisten unserer Ergebnisse lassen sich mit der Annahme erklären, dass der Kryoschutz im Bereich von 4 K stark davon abhängt die Temperatur.[12]

Diese Ergebnisse waren jedoch nicht reproduzierbar, und nur zwei Jahre später wurden Änderungen in Nature veröffentlicht, aus denen hervorgeht, dass der Strahlwiderstand weniger signifikant war als ursprünglich angenommen. Der bei 4 K erzielte Schutz war näher an “zehnfach für Standardproben von L-Valin”.[13] als das, was zuvor angegeben wurde.

1981 berichteten Alasdair McDowall und Jacques Dubochet, Wissenschaftler des European Molecular Biology Laboratory, über die erste erfolgreiche Implementierung von Kryo-EM.[14]McDowall und Dubochet verglasten reines Wasser in einem dünnen Film, indem sie es auf einen hydrophilen Kohlenstofffilm sprühten, der schnell in Kryogen getaucht wurde (flüssiges Propan oder flüssiges Ethan, abgekühlt auf 100 K). Die dünne Schicht aus amorphem Eis war weniger als 1 um dick und ein Elektronenbeugungsmuster bestätigte das Vorhandensein von amorphem / glasartigem Eis. Im Jahr 1984 demonstrierte Dubochets Gruppe die Kraft von Kryo-EM in der Strukturbiologie mit der Analyse von verglastem Adenovirus Typ 2, T4-Bakteriophagen, Semliki-Forest-Virus, Bakteriophagen CbK und Vesikulär-Stomatitis-Virus.[15]

Nobelpreis für Chemie 2017[edit]

Im Jahr 2017 erhielten drei Wissenschaftler, Jacques Dubochet, Joachim Frank und Richard Henderson, den Nobelpreis für Chemie für die Entwicklung einer Technik zur Abbildung von Biomolekülen.[4]

Möglicher Rivale zur Röntgenkristallographie[edit]

Ab dem 27. Oktober 2020 wurde die Röntgenkristallographie zur Abbildung von 150494 biologischen Proben verwendet und ist die dominierende Technik in der biologischen Mikroskopie, wobei Cyro-EM mit nur 6016 weit zurückliegt.[16]

Laut Nature gibt es jedoch Fortschritte bei Direktelektronendetektoren (oft als Direktdetektionsgerät oder DDD bezeichnet) an der Universität von Cambridge[17] und Automatisierung der Probenproduktion durch SPT Labtech[18] hat zu einer Zunahme der Verwendung in biologischen Bereichen geführt,[19] Cryo-EM zu einem potenziellen Rivalen machen.

Die Auflösung der Röntgenkristallographie ist durch die Kristallreinheit begrenzt.[20] Das Erstellen dieser Proben ist sehr zeitaufwändig und dauert bis zu Monaten oder sogar Jahren.[19] Einige Proteine ​​sind auch schwer zu kristallisieren.[19][21] Obwohl die Probenvorbereitung für Cryo-EM immer noch mühsam ist,[22] Diese Probleme treten nicht auf, da die Stichprobe in ihrem „ursprünglichen Zustand“ beobachtet wird.[21]

Laut Proteopedia beträgt die durch Röntgenkristallographie (Stand 19. Mai 2019) in der Proteindatenbank erreichte mittlere Auflösung 2,05 Å,[20] und die höchste jemals erreichte Auflösung (Stand 27. Oktober 2020) beträgt 0,48 Å.[23] Kryo-EM-Auflösungen nähern sich jetzt 1,5 Å,[24] Dies macht es zu einem fairen Konkurrenten bei der Lösung.

Korrekturlicht Cryo-TEM und Cryo-ET[edit]

Im Jahr 2019 wurden mit korrelativem Licht Cyro-TEM und Cryo-ET Tunnel-Nanoröhren (TNTs) in neuronalen Zellen beobachtet.[25]

Rasterelektronen-Kryomikroskopie[edit]

Die Rasterelektronen-Kryomikroskopie (cryoSEM) ist eine Rasterelektronenmikroskopie-Technik mit dem kalten Tisch eines Rasterelektronenmikroskops in einer Kryokammer.

Siehe auch[edit]

Verweise[edit]

  1. ^ Xiao, C., Fischer, MG, Bolotaulo, DM, Ulloa-Rondeau, N., Avila, GA und Suttle, CA (2017) “Die Kryo-EM-Rekonstruktion des Cafeteria roenbergensis-Virus-Kapsids legt einen neuen Assemblierungsweg für Riesenviren nahe.” . Wissenschaftliche Berichte, 7: 5484. doi:10.1038 / s41598-017-05824-w.
  2. ^ Tivol, William F.; Briegel, Ariane; Jensen, Grant J. (Oktober 2008). “Ein verbessertes Kryogen zum Einfrieren”. Mikroskopie und Mikroanalyse. 14 (5): 375–379. doi:10.1017 / S1431927608080781. ISSN 1431-9276. PMC 3058946. PMID 18793481.
  3. ^ Cheng Y., Grigorieff N., Penczek PA, Walz T. (April 2015). “Ein Primer für die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie”. Zelle. 161 (3): 438–449. doi:10.1016 / j.cell.2015.03.050. PMC 4409659. PMID 25910204.
  4. ^ ein b Cressey D, Callaway E (Oktober 2017). “Kryo-Elektronenmikroskopie gewinnt Chemie-Nobelpreis”. Natur. 550 (7675): 167. Bibcode:2017Natur.550..167C. doi:10.1038 / nature.2017.22738. PMID 29022937.
  5. ^ Doerr, Allison (Januar 2017). “Kryo-Elektronentomographie”. Naturmethoden. 14 (1): 34. doi:10.1038 / nmeth.4115. ISSN 1548-7091. S2CID 27162203.
  6. ^ Nannenga, Brent L; Shi, Dan; Leslie, Andrew GW; Gonen, Tamir (03.08.2014). “Hochauflösende Strukturbestimmung durch kontinuierliche Rotationsdatenerfassung in MicroED”. Naturmethoden. 11 (9): 927–930. doi:10.1038 / nmeth.3043. PMC 4149488. PMID 25086503.
  7. ^ Jones, Christopher G.; Martynowycz, Michael W.; Hattne, Johan; Fulton, Tyler J.; Stoltz, Brian M.; Rodriguez, Jose A.; Nelson, Hosea M.; Gonen, Tamir (2018-11-02). “Die CryoEM-Methode MicroED als leistungsstarkes Werkzeug zur Bestimmung der Struktur kleiner Moleküle”. ACS Central Science. 4 (11): 1587–1592. doi:10.1021 / acscentsci.8b00760. PMC 6276044. PMID 30555912.
  8. ^ de la Cruz, M. Jason; Hattne, Johan; Shi, Dan; Seidler, Paul; Rodriguez, Jose; Reyes, Francis E; Sawaya, Michael R; Cascio, Duilio; Weiss, Simon C (2017). “Atomauflösende Strukturen aus fragmentierten Proteinkristallen mit der CryoEM-Methode MicroED”. Naturmethoden. 14 (4): 399–402. doi:10.1038 / nmeth.4178. PMC 5376236. PMID 28192420.
  9. ^ Gruene T., Wennmacher J. T., Zaubitzer C., Holstein J. J., Heidler J., Fecteau-Lefebvre A., De Carlo S., Müller E., Goldie K., Regeni I., Li T., Santiso-Chinone G., Steinfeld G., Handschin S., van Genderen E. van Bokhoven JA, Clever GH, Pantelic R (Oktober 2018). “Schnelle Strukturbestimmung mikrokristalliner molekularer Verbindungen mittels Elektronenbeugung”. Angewandte Chemie. 57 (50): 16313–16317. doi:10.1002 / anie.201811318. PMC 6468266. PMID 30325568.
  10. ^ Cheng, Yifan (2018-08-31). “Einzelpartikel-Kryo-EM – Wie ist es hierher gekommen und wohin wird es gehen?”. Wissenschaft. 361 (6405): 876–880. doi:10.1126 / science.aat4346. ISSN 0036-8075. PMC 6460916. PMID 30166484.
  11. ^ Dubochet J, Knapek E (April 2018). “Höhen und Tiefen in der frühen Elektronen-Kryo-Mikroskopie”. PLOS Biologie. 16 (4): e2005550. doi:10.1371 / journal.pbio.2005550. PMC 5929567. PMID 29672565.
  12. ^ Knapek E, Dubochet J (August 1980). “Strahlschäden an organischem Material werden in der Kryo-Elektronenmikroskopie erheblich reduziert”. Journal of Molecular Biology. 141 (2): 147–61. doi:10.1016 / 0022-2836 (80) 90382-4. PMID 7441748.
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  25. ^ Sartori-Rupp, Anna; Cordero Cervantes, Diégo; Pepe, Anna; Gousset, Karine; Delage, Elise; Corroyer-Dulmont, Simon; Schmitt, Christine; Krijnse-Locker, Jacomina; Zurzolo, Chiara (Dezember 2019). “Korrelative Kryo-Elektronenmikroskopie zeigt die Struktur von TNTs in neuronalen Zellen”. Naturkommunikation. 10 (1): 342. doi:10.1038 / s41467-018-08178-7. ISSN 2041-1723. PMC 6341166. PMID 30664666.


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