Schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie – Wikipedia

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Schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC)ist eine Form der Flüssigkeitschromatographie, die häufig zur Analyse oder Reinigung von Proteinmischungen verwendet wird. Wie bei anderen Formen der Chromatographie ist eine Trennung möglich, da die verschiedenen Komponenten eines Gemisches unterschiedliche Affinitäten für zwei Materialien aufweisen, ein sich bewegendes Fluid (die mobile Phase) und einen porösen Feststoff (die stationäre Phase). In der FPLC ist die mobile Phase eine wässrige Lösung oder ein “Puffer”.[1] Die Pufferdurchflussrate wird von einer Verdrängerpumpe gesteuert und normalerweise konstant gehalten, während die Zusammensetzung des Puffers variiert werden kann, indem Flüssigkeiten in unterschiedlichen Anteilen aus zwei oder mehr externen Behältern entnommen werden. Die stationäre Phase ist ein Harz, das aus Perlen besteht, üblicherweise aus vernetzter Agarose, die in eine zylindrische Glas- oder Kunststoffsäule gepackt sind. FPLC-Harze sind je nach Anwendung in einer Vielzahl von Perlengrößen und Oberflächenliganden erhältlich.

Bei der gebräuchlichsten FPLC-Strategie, dem Ionenaustausch, wird ein Harz ausgewählt, bei dem das interessierende Protein durch eine Ladungswechselwirkung im Puffer A (dem Laufpuffer) an das Harz bindet, jedoch dissoziiert und in Puffer B (der Elution) zur Lösung zurückkehrt Puffer). Eine Mischung, die ein oder mehrere interessierende Proteine ​​enthält, wird in 100% Puffer A gelöst und in die Säule gepumpt. Die interessierenden Proteine ​​binden an das Harz, während andere Komponenten im Puffer ausgeführt werden.[2] Die Gesamtflussrate des Puffers wird konstant gehalten; Der Anteil von Puffer B (der “Elutions” -Puffer) wird jedoch gemäß einer programmierten Konzentrationsänderung (dem “Gradienten”) allmählich von 0% auf 100% erhöht. Irgendwann während dieses Prozesses dissoziiert jedes der gebundenen Proteine ​​und erscheint im Elutionsmittel. Das Elutionsmittel durchläuft zwei Detektoren, die die Salzkonzentration (durch Leitfähigkeit) und die Proteinkonzentration (durch Absorption von ultraviolettem Licht bei einer Wellenlänge von 280 nm) messen. Wenn jedes Protein eluiert wird, erscheint es im Elutionsmittel als “Peak” der Proteinkonzentration und kann zur weiteren Verwendung gesammelt werden.[3]

FPLC wurde 1982 von Pharmacia in Schweden entwickelt und vermarktet.[4] und wurde ursprünglich genannt schnelle Flüssigchromatographie im Gegensatz zu HPLC oder Hochleistungsflüssigchromatographie. FPLC wird im Allgemeinen nur auf Proteine ​​angewendet; Aufgrund der großen Auswahl an Harzen und Puffern findet es jedoch breite Anwendung. Im Gegensatz zur HPLC ist der verwendete Pufferdruck relativ niedrig, typischerweise weniger als 5 bar, aber die Fließgeschwindigkeit ist relativ hoch, typischerweise 1 bis 5 ml / min. FPLC kann leicht von der Analyse von Milligramm Gemischen in Säulen mit einem Gesamtvolumen von 5 ml oder weniger bis zur industriellen Herstellung von Kilogramm gereinigtem Protein in Säulen mit Volumina von vielen Litern skaliert werden. Bei der Analyse von Gemischen wird das Elutionsmittel üblicherweise in Fraktionen von 1 bis 5 ml gesammelt, die weiter analysiert werden können (beispielsweise durch MALDI-Massenspektrometrie). Bei Verwendung zur Proteinreinigung dürfen nur zwei Sammelbehälter vorhanden sein: einer für das gereinigte Produkt und einer für Abfall.[5]

FPLC-Systemkomponenten[edit]

Ein typischer Labor-FPLC besteht aus einer oder zwei hochpräzisen Pumpen, einer Steuereinheit, einer Säule, einem Detektionssystem und einem Fraktionssammler. Obwohl es möglich ist, das System manuell zu bedienen, sind die Komponenten normalerweise mit einem Personal Computer oder in älteren Einheiten mit einem Mikrocontroller verbunden.

Pumps[edit]

Die meisten Systeme verwenden zwei Zweizylinder-Kolbenpumpen, eine für jeden Puffer, die die Leistung beider in einer Mischkammer kombinieren. Einige einfachere Systeme verwenden eine einzelne peristaltische Pumpe, die beide Puffer aus getrennten Behältern durch ein Dosierventil und eine Mischkammer zieht. In jedem Fall ermöglicht das System, dass der Anteil jedes in die Säule eintretenden Puffers kontinuierlich variiert wird. Die Durchflussrate kann von einigen Millilitern pro Minute in Tischsystemen bis zu Litern pro Minute für Reinigungen im industriellen Maßstab reichen. Der große Durchflussbereich macht es sowohl für die analytische als auch für die präparative Chromatographie geeignet.

Injektionsschleife[edit]

Die Injektionsschleife ist ein Schlauchabschnitt mit bekanntem Volumen, der mit der Probenlösung gefüllt wird, bevor sie in die Säule injiziert wird. Das Schleifenvolumen kann von einigen Mikrolitern bis zu 50 ml oder mehr reichen.

Einspritzventil[edit]

Das Einspritzventil ist ein motorisiertes Ventil, das den Mischer und die Probenschleife mit der Säule verbindet. Typischerweise hat das Ventil drei Positionen zum Laden des Probenkreislaufs, zum Einspritzen der Probe aus dem Kreislauf in die Säule und zum direkten Anschließen der Pumpen an die Abfallleitung, um sie zu waschen oder Pufferlösungen zu wechseln. Das Injektionsventil hat eine Probenladeöffnung, durch die die Probe in die Injektionsschleife geladen werden kann, üblicherweise von einer Injektionsspritze unter Verwendung einer Luer-Lock-Verbindung.

Säule[edit]

Die Säule ist ein Glas- oder Kunststoffzylinder, der mit Harzperlen gefüllt und mit Pufferlösung gefüllt ist. Es wird normalerweise vertikal montiert, wobei der Puffer von oben nach unten nach unten fließt. Eine Glasfritte am Boden der Säule hält die Harzkügelchen in der Säule zurück, während der Puffer und die gelösten Proteine ​​austreten können.

Durchflusszelle[edit]

Das Elutionsmittel aus der Säule passiert eine oder mehrere Durchflusszellen, um die Proteinkonzentration im Elutionsmittel zu messen (durch UV-Lichtabsorption bei 280 nm). Die Leitfähigkeitszelle misst die Pufferleitfähigkeit, üblicherweise in Millisiemens / cm, die die Salzkonzentration im Puffer angibt. Üblicherweise ist auch eine Durchflusszelle enthalten, die den pH-Wert des Puffers misst. Normalerweise ist jede Durchflusszelle mit einem separaten Elektronikmodul verbunden, das Strom liefert und das Signal verstärkt.

Monitor / Rekorder[edit]

Die Durchflusszellen sind mit einem Display und / oder Rekorder verbunden. Auf älteren Systemen war dies ein einfacher Schreiber, auf modernen Systemen wird ein Computer mit Hardwareschnittstelle und Anzeige verwendet. Dies ermöglicht es dem Experimentator zu identifizieren, wann Spitzen in der Proteinkonzentration auftreten, was darauf hinweist, dass bestimmte Komponenten der Mischung eluiert werden.

Fraktionssammler[edit]

Der Fraktionssammler ist typischerweise ein rotierendes Gestell, das mit Reagenzgläsern oder ähnlichen Behältern gefüllt werden kann. Es ermöglicht die Entnahme von Proben in festen Volumina oder die Steuerung spezifischer Fraktionen, die als Spitzenwerte der Proteinkonzentration nachgewiesen wurden, in getrennte Behälter.

Viele Systeme enthalten verschiedene optionale Komponenten. Zwischen dem Mischer und der Säule kann ein Filter hinzugefügt werden, um ein Verstopfen zu minimieren. In großen FPLC-Säulen kann die Probe direkt unter Verwendung einer kleinen peristaltischen Pumpe anstelle einer Injektionsschleife in die Säule geladen werden. Wenn der Puffer gelöstes Gas enthält, können sich Blasen bilden, wenn der Druck dort abfällt, wo der Puffer aus der Säule austritt. Diese Blasen erzeugen Artefakte, wenn sie die Durchflusszellen passieren. Dies kann verhindert werden, indem die Puffer entgast werden, z. B. mit einem Entgaser, oder indem ein Durchflussbegrenzer stromabwärts der Durchflusszellen hinzugefügt wird, um einen Druck von 1 bis 5 bar in der Elutionsmittelleitung aufrechtzuerhalten.

FPLC-Spalten[edit]

Die in FPLC verwendeten Spalten sind groß [mm id] Röhren, die kleine enthalten [µ] Partikel oder Gelkügelchen, die als stationäre Phase bekannt sind.[6] Das chromatographische Bett besteht aus den Gelkügelchen innerhalb der Säule, und die Probe wird in den Injektor eingeführt und durch das fließende Lösungsmittel in die Säule befördert. Infolge der Anhaftung oder Diffusion verschiedener Komponenten durch das Gel wird die Probenmischung abgetrennt.[7]

Mit einem FPLC verwendete Säulen können Makromoleküle nach Größe, Ladungsverteilung (Ionenaustausch), Hydrophobizität, Umkehrphase oder Biorekognition (wie bei der Affinitätschromatographie) trennen.[8] Zur einfachen Verwendung steht eine breite Palette vorgepackter Säulen für Techniken wie Ionenaustausch, Gelfiltration (Größenausschluss), hydrophobe Wechselwirkung und Affinitätschromatographie zur Verfügung.[9] FPLC unterscheidet sich von HPLC darin, dass die für FPLC verwendeten Säulen nur bis zu einem maximalen Druck von 3-4 MPa (435-580 psi) verwendet werden können. Wenn also der Druck der HPLC begrenzt werden kann, kann jede FPLC-Säule auch in einer HPLC-Maschine verwendet werden.

Optimierung der Proteinreinigung[edit]

Kombinationen von chromatographischen Methoden können verwendet werden, um ein Zielmolekül zu reinigen. Der Zweck der Reinigung von Proteinen mit FPLC besteht darin, Mengen des Ziels in ausreichender Reinheit in einem biologisch aktiven Zustand abzugeben, um seiner weiteren Verwendung zu entsprechen. Die Qualität des Endprodukts variiert in Abhängigkeit von Art und Menge des Ausgangsmaterials, der Effizienz der Trennung und der Selektivität des Reinigungsharzes. Das ultimative Ziel eines gegebenen Reinigungsprotokolls besteht darin, die erforderliche Ausbeute und Reinheit des Zielmoleküls auf die schnellste, billigste und sicherste Weise für akzeptable Ergebnisse zu liefern. Der erforderliche Reinheitsbereich kann von dem für die Basisanalyse (z. B. SDS-PAGE oder ELISA) erforderlichen Bereich, bei dem nur Massenverunreinigungen entfernt werden, bis zu einem für die Strukturanalyse (NMR- oder Röntgenkristallographie) ausreichend reinen Bereich reichen, der sich einem Ziel von> 99% nähert Molekül. Erforderliche Reinheit kann auch so rein sein, dass die biologische Aktivität des Ziels erhalten bleibt. Diese Anforderungen können verwendet werden, um die Menge an Ausgangsmaterial zu bestimmen, die erforderlich ist, um das experimentelle Ziel zu erreichen. Wenn das Ausgangsmaterial begrenzt ist und keine vollständige Optimierung des Reinigungsprotokolls durchgeführt werden kann, wird ein sicheres Standardprotokoll erwartet, das ein Minimum an Anpassungs- und Optimierungsschritten erfordert. Dies ist möglicherweise nicht optimal in Bezug auf Versuchszeit, Ausbeute und Wirtschaftlichkeit, erreicht jedoch das Versuchsziel. Wenn andererseits das Ausgangsmaterial ausreicht, um ein vollständigeres Protokoll zu entwickeln, hängt der Arbeitsaufwand zum Erreichen des Trennungsziels von den verfügbaren Probeninformationen und den Eigenschaften der Zielmoleküle ab. Die Grenzen der Entwicklung von Reinigungsprotokollen hängen oft von der Quelle der zu reinigenden Substanz ab, sei es aus natürlichen Quellen (z. B. geernteten Geweben oder Organismen), rekombinanten Quellen (wie der Verwendung prokaryotischer oder eukaryotischer Vektoren in ihren jeweiligen Expressionssystemen). oder völlig synthetische Quellen.

Keine chromatographischen Techniken liefern eine 100% ige Ausbeute an aktivem Material und die Gesamtausbeute hängt von der Anzahl der Schritte im Reinigungsprotokoll ab. Indem jeder Schritt für den beabsichtigten Zweck optimiert und so angeordnet wird, dass die Behandlungen zwischen den Schritten minimiert werden, wird die Anzahl der Schritte minimiert.

Ein typisches mehrstufiges Reinigungsprotokoll beginnt mit einem vorläufigen Einfangschritt, bei dem häufig die Ionenaustauschchromatographie (IEC) verwendet wird. Das Medienharz (stationäre Phase) besteht aus Kügelchen, deren Größe von groß (gut für schnelle Fließgeschwindigkeiten und geringe bis keine Probenklärung auf Kosten der Auflösung) bis klein (für eine bestmögliche Auflösung bei gleichbleibenden anderen Faktoren) reicht. . Kurze und breite Säulengeometrien sind auch auf Kosten der Auflösung für hohe Durchflussraten zugänglich, typischerweise aufgrund der seitlichen Diffusion der Probe auf der Säule. Damit Techniken wie die Größenausschlusschromatographie nützlich sind, sind sehr lange, dünne Säulen und minimale Probenvolumina (maximal 5% des Säulenvolumens) erforderlich. Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) kann auch für erste und / oder Zwischenschritte verwendet werden. Die Selektivität in HIC ist unabhängig vom laufenden pH-Wert und es werden absteigende Salzgradienten verwendet. Bei der HIC umfasst die Konditionierung die Zugabe von Ammoniumsulfat zur Probe, um die Puffer A-Konzentration anzupassen. Wenn HIC vor der IEC verwendet wird, müsste die Ionenstärke durch Verdünnen, Dialyse oder Pufferaustausch durch Gelfiltration verringert werden, um der von Puffer A für den IEC-Schritt zu entsprechen. Aus diesem Grund wird die IEC normalerweise vor der HIC durchgeführt, da die Bedingungen für die hohe Salzelution für die IEC ideal sind, um im nächsten Reinigungsschritt an HIC-Harze zu binden. Das Polieren wird verwendet, um das erforderliche Endreinigungsniveau zu erreichen, und wird üblicherweise an einer Gelfiltrationssäule durchgeführt. Ein zusätzlicher Zwischenreinigungsschritt kann hinzugefügt werden oder eine Optimierung der verschiedenen Schritte wird durchgeführt, um die Reinheit zu verbessern. Dieser zusätzliche Schritt beinhaltet normalerweise eine weitere Runde IEC unter völlig anderen Bedingungen.

Obwohl dies ein Beispiel für ein gemeinsames Reinigungsprotokoll für Proteine ​​ist, können die Pufferbedingungen, Flussraten und Harze, die zur Erreichung der endgültigen Ziele verwendet werden, so ausgewählt werden, dass sie einen breiten Bereich von Zielproteinen abdecken. Diese Flexibilität ist für ein funktionelles Reinigungssystem unerlässlich, da sich alle Proteine ​​unterschiedlich verhalten und häufig von Vorhersagen abweichen.[10]

Verweise[edit]

  1. ^ Pontis HG (2017-01-01). “Kapitel 3 – Trennung und Reinigung von Proteinen und Kohlenhydraten”. In Pontis HG (Hrsg.). Methoden zur Analyse des Kohlenhydratstoffwechsels in photosynthetischen Organismen. Boston: Akademische Presse. S. 45–63. doi:10.1016 / b978-0-12-803396-8.00003-x. ISBN 978-0-12-803396-8.
  2. ^ Rutkowski JM, Scherer PE (01.01.2014). Macdougald O (Hrsg.). “Isolierung und Quantifizierung von Adiponectin-Komplexen höherer Ordnung”. Methoden der Enzymologie. Methoden der Fettgewebebiologie, Teil A. Academic Press. 537: 243–59. doi:10.1016 / b978-0-12-411619-1.00013-6. ISBN 9780124116191. PMC 4040967. PMID 24480350.
  3. ^ “Chromatographie, Theorien, FPLC und darüber hinaus” (PDF). Archiviert von das Original (PDF) am 28.03.2014.>
  4. ^ Moreno-Arribas MV (2003-01-01), “CHROMATOGRAPHY | High-Performance Liquid Chromatography”, in Caballero B, Polo MC (Hrsg.), Enzyklopädie der Lebensmittelwissenschaften und Ernährung (2. Auflage), Oxford: Academic Press, S. 1274–1280, doi:10.1016 / b0-12-227055-x / 00232-7, ISBN 978-0-12-227055-0
  5. ^ Sheehan D, O’Sullivan S. (2003). “Schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie”. In Cutler P (Hrsg.). Proteinreinigungsprotokolle. Methoden der Molekularbiologie. 244. S. 253–8. doi:10.1385 / 1-59259-655-X: 253. ISBN 978-1-59259-655-3. PMID 14970563.
  6. ^ Aluko RE (Januar 2018). “Von Nahrungsproteinen abgeleitete Peptide: Herstellung, Isolierung und Reinigung.” Proteine ​​in der Lebensmittelverarbeitung. Woodhead Publishing. S. 389–412. doi:10.1016 / b978-0-08-100722-8.00016-4. ISBN 978-0-08-100722-8.
  7. ^ “FPLC Alles was Sie wissen müssen”. Wenn die Lösungsmittel durch die Fließgeschwindigkeit in das Chromatographiebett gedrückt werden, trennt sich die Probe in verschiedene Zonen von Probenkomponenten, die als Banden bezeichnet werden.>
  8. ^ Verbeke K, Verbruggen A (Juni 1996). “Nützlichkeit der schnellen Proteinflüssigkeitschromatographie als Alternative zur Hochleistungsflüssigchromatographie von 99mTc-markierten Humanserumalbuminpräparaten”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 14 (8–10): 1209–13. doi:10.1016 / S0731-7085 (95) 01755-0. PMID 8818035.
  9. ^ Göke B, Keim V (April 1992). “HPLC und FPLC. Jüngste Fortschritte bei der Verwendung automatisierter Chromatographiesysteme zur Auflösung von sekretorischen Pankreasproteinen”. Internationale Zeitschrift für Pankreatologie. 11 (2): 109–16. doi:10.1007 / BF02925982 (inaktiv 2020-11-11). PMID 1607728.CS1-Wartung: DOI ab November 2020 inaktiv (Link)
  10. ^ “Strategien zur Proteinreinigung Handbuch” (PDF). GE Healthcare Bio-Sciences AB.

Externe Links[edit]

Beispiel für eine FPLC-Risikobewertung (Leeper Group, Universität Cambridge)


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