¿überexport – ウィキペディア

Posted on by
before-content-x4

いつ 過剰発現 細胞内の遺伝子の発現が大幅に増加したことを指す場合。これにより、この遺伝子によってコード化されたタンパク質の合成がそれに応じて増加します。

自然な過剰発現は、ウイルス感染の文脈で発生する可能性があります、 [初め] 誤った遺伝子調節によって引き起こされる腫瘍の場合、または実験室で人為的に発現ベクターの助けを借りて組換えタンパク質を産生します。

組換えタンパク質を生成するために、過剰発現の適用には2つの領域があります。

  • 後の精製とさらなる使用のためのタンパク質の過剰発現（ここでは、研究目的で少量のタンパク質を生成するはずの経済プロセスとプロセスを区別できます））
  • タンパク質とその特性と生産生物への影響を分析する過剰発現

分析的過剰発現では、プロセスの経済にあまり重点が置かれていません。生産は最適化されていませんが、通常、市販の標準システムが実証されているために使用されます。高級、d。 H.高レベルの群衆は計画されていません。

生産プロセスを確立するとき、最も安定した生産的なプロセスを取得するために、過剰発現が最適化されることがよくあります。ここでは、可能な限り最大の製品量を取得するために、遺伝的およびプロセスエンジニアリングレベルでさまざまなパラメーターが異なります。

プロカリオテン [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

原核生物における発現を超えるタンパク質の最も一般的な形態は、プラスミドベクターの使用です。ここでは、発現カセットがプラスミド（局在化）に取り付けられ、生物に変換され、栽培期間中にそこで安定化されます。この方法の利点は、遺伝的に単純な作業方法と、プラスミドのコピー数を介して達成される高い節症にあります。

after-content-x4

原核生物における過剰発現のもう1つの方法は、過剰発現カセットのゲノム設置です。過剰発現のために、おそらくRNA安定化修飾と組み合わされる強力なプロモーターシステムを選択するか、カセットをゲノムに複数統合することにより高い格納を選択する必要があります。

ファージジェノマの過剰発現のために遺伝子を局在することも可能です。発現システムは、遺伝子組み換えファージに感染します。ファージによる細菌の代謝を引き継ぐ過程で、標的遺伝子もますます発現しています。

ユーカリーナッツ [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

遺伝子は真核生物でも過剰発現しています。これは、細胞培養または完全な生物で行うことができます。一時的またはゲノム統合された発現カセットは、完全な生物の過剰発現に使用されます。 CMVプロモーターとCAGプロモーターは、プロモーターとして使用されます。プラスミドは、細胞培養での発現にも使用されます。対応する発現カセットを含む細菌で産生される大量のプラスミドDNAが細胞に持ち込まれます。しかし、プラスミドは真核細胞では複製できないため、しばらくすると失われます。この方法は、細胞に対する過剰発現の効果を特徴付けるために、研究目的でよく使用されます。通常、生産トランクは、カセットのゲノム統合によって作成されます。

セル – フリー式 [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

細胞を含まない遺伝子発現は、プラスミドまたはmRNA、次に細胞なしで移動する細胞ライステの産生に基づいています（ 試験管内で ）コード化された標的タンパク質を作ります。この方法はまだ比較的非効率的です。高毒性製品の生産に適しています。 [2] [3] [4]

原則として、過剰発現には2つの表現の可能性があります。

  • 連続的な表現
  • 誘導された発現

連続的な発現では、遺伝子は構成的プロモーター全体で発現し、対応するタンパク質は細胞に蓄積されます。

誘導された発現では、誘導性プロモーターが使用されます。インダクタは、標的遺伝子の発現、つまり活性化されます。この方法は、過剰発現が生産生物にマイナスの影響を与える場合によく使用されます。この理由の1つはです細胞の代謝資源の高いストレスと、生産段階での代謝河川（フラックス）の変化。 「通常の条件」では、両方のパラメーターが細胞によって調節されるため、細胞の増殖と代謝に役立つ細胞所有タンパク質（宿主細胞タンパク質）の形成にのみ使用されます。さらに、もたらされた標的遺伝子の転写中の高濃度のmRNAの形成は、成長を阻害する可能性があります。さらに、の蓄積の増加 インクルージョンボディ 細胞増殖の阻害に対する標的タンパク質の。 [5] これらの付随する効果は用語の下にあります 代謝負担 要約。成長が遅いことの結果は、特に産業プロセスに関連するバイオリアクターの延長された条件であり、生産コストの増加です。細胞毒性製品で誘導された発現も利点です。ここでは、発現の誘導後、自己毒と細胞が死にます。したがって、生産プロセスの経済に関しては、プロセスを成長段階と生産段階に分割しようとします。成長段階では、可能な最大のバイオマスが生成され、産生段階では、標的タンパク質がプロモーターの誘導によって生成されます。このようにして、セルが死ぬ前に最大の製品量を取得するため、プロセスはより経済的になります。

組換えタンパク質の過剰発現のために頻繁に使用されるシステムは、グラム陰性菌です 大腸菌 。ただし、グラム陽性など、他のさまざまな生物が現在使用されています Bacillus Megaterium 、コリー・ネルバクテリアと酵母。真核生物の発現はさまざまなタンパク質に必要であるため、動物細胞株（SF9細胞、選択細胞、ベロ細胞、またはHEK細胞など）などのさまざまな細胞培養株も使用されます。一部のタンパク質は、植物などの遺伝子組み換え生物でも産生されます。ヤギや牛などの高等真核生物の生物全体も頻繁に使用されません。

after-content-x4

国内基板を介した標的過剰発現 大腸菌 [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

モデル生物の細胞におけるタンパク質の標的過剰発現（例： 大腸菌 ）トランスジェンの助けを借りて、生物学的および医学的研究の可能性は、さらなる実験でその機能または構造を調べるために、より多くの量（数mg）のタンパク質を生成することです。
一般的な方法は、トランスゲンの過剰発現であり、その転写は細菌LACオペロンによって調節されています。

ベクトル [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

ベクターは、PBR322プラスミドに基づいて最も頻繁に使用され、PUCプラスミドやPETベクターなどのVectord設計によって適応されます。

誘導 [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

プロモーターを誘導するための最も広範なシステムはLACオペロンです 大腸菌 。乳糖またはIPTGのいずれかがインダクタとして使用されます。しかし、アラビナ症（PBADシステムを参照）またはラムノース（cf.をcf.cf. 大腸菌 krx）はインダクタとして広まっています。物理的誘導のシステムは、たとえば、誘導される温度です コールドショック – に基づくプロモーターシステム 大腸菌 CSPAプロモーターDer Firm Takara。

プロモーター [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

異なるプロモーターを備えた商用システムの選択は比較的大きいです。 T7プロモーターやBLAプロモーターなどの天然プロモーターは、プロモーターTRPからのハイブリッド、TACプロモーターなどの合成プロモーターとハイブリッドプロモーターも使用されます。 大腸菌 。

遺伝的要件 [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

トランスジェンは、プラスミド上の細菌ゲノムの外側にあります。実際のコーディング領域が始まる前、つまり 上流の トランスジェンのうち、LACオペロンのオペレーターがあります（ ラコ ）。プラスミドには遺伝子も含まれています laci 、Lac Repressor Laciのコード化。 Laciはオペレーターにバインドします ラコ トランスジェンの前にそのプロモーターをブロックする前に、トランスジェンの発現、したがってコード化されたタンパク質の過剰生産を防ぎます。

IPTGによる基板 [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

アロラクト症に非常によく似た分子であるIPTGは、トランスジェンの前にオペレーターに座っているリプレッサーに結合します。これにより、リプレッサーの立体構造が変化し、DNAに結合することができなくなり、オペレーターを放出できます。これにより、プロモーターはRNAポリメラーゼにアクセスできます。プロモーターへの結合は、mRNAにDNAの転写を導入します。

過剰発現に適したプロモーター [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

転写のみの開始のためのプロモーターの放出は、非常に大量のタンパク質を生成するのに十分ではありません。このためには、大量のmRNAが存在する必要があります。つまり、転写は非常に効率的でなければなりません。 RNAポリメラーゼを迅速に連続してプロモーターにリクルートし、転写の開始を同じくらい速く可能にする強力なプロモーターが必要です。
これの例は次のとおりです T7 -地方検事 [6] 同じ名前またはのバクテリオファージから TAC – プロモーターからのハイブリッド trp と ラック それらを介してそれらを介して 大腸菌 。 [7] ただし、T7プロモーターの場合、対応するT7 RNAポリメラーゼも発現システムのゲノムに存在する必要があります。 [8]

  • ジョセフ・サンブルック、デビッド・W・ラッセル： 分子クローニング。実験室マニュアル。 第3巻。第3版。 Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク2001年、ISBN 0-87969-576-5。
  1. ↑ マーククルッツu。 a。： プログラヌリンのヌル変異は、染色体17q21に関連するユビキチン陽性前頭口頭認知症を引き起こします。 の： 自然。 442、S。920–924（24。2006年8月） doi：10.1038/nature05017 。
  2. ↑ Ma Y、Ghoshdastider U、Wang J、Ye W、Dötschv、Filipek S、Bernhard F、Wang X： 阻害剤スクリーニングのためのヒトグルコサミン6-リン酸N-アセチルトランスフェラーゼ（HSGNA1）の細胞を含まない発現。 の： タンパク質消費純版 。 86年、 いいえ。 2 、2012、 S. 120–126 、doi： 10.1016/j.pep.2012.09.011 、 PMID 23036358 。
  3. ↑ C. Roos、L。Kai、S。Haberstock、D。Proverb、U。Ghoshdastider、Y。Ma、S。Filipek、X。Wang、V。Dötch、F。Bernhard： ナノディスクによる膜タンパク質の高レベルの細胞のない産生 。の： 分子生物学の方法 。 2014年1118年、 S. 109–30 、doi： 10,1007/978-1-62703-782-2_7_7 、 PMID 24395412 。
  4. ↑ C Roos、L Kai、D Proverb、U Ghoshdastider、S Finipek、VDötsch、F Bernhard： 供給された脂質二重層との細胞を含まない膜タンパク質の同時翻訳関連 。の： 分子膜生物学 。 30年、 いいえ。 初め 、 2013、 S. 75–89 、doi： 10,3109/09687688.2012.693212 、 PMID 22716775 。
  5. ↑ Zhaopeng Li＆Ursula Rine： 組換えタンパク質産生関連成長阻害は、主に転写からであり、翻訳からではありません 。の： 微生物の事実 。 バンド 19 、 いいえ。 83 、2020、doi： 10.1186/s12934-020-01343-y 。
  6. ↑ D. A.ミード、E。Szczesna-Skorupa、B。Kemper： 一本鎖DNA ‘Blue’ T7プロモータープラスミド：クローニングおよびタンパク質工学のための汎用性の高いタンデムプロモーターシステム。 の： タンパク質工学。 1986年生まれ、No。1、pp。67–74。
  7. ↑ H. A. de Boer、L。J。Comstock、M。Vasser： TACプロモーター：TRPおよびLACプロモーターに由来する機能的なハイブリッド。 の： 国立科学アカデミーの議事録。 いいえ。 80、1983、pp。21–25。
  8. ↑ T7プロモーターシステム 2011年5月29日にアクセスされたSigma-Aldrich Webサイト。
after-content-x4