Taq Polymerase – Wikipedia

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Thermostabile Form der DNA-Polymerase I, die bei der Polymerasekettenreaktion verwendet wird

DNA-Polymerase I, thermostabil
PDB 1ktq EBI.jpg

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Großes (Klenow) Fragment von Taq polA, das die polA- und Restdomänen enthält
Kennungen
Organismus Thermus aquaticus
Symbol polA
UniProt P19821

Taq Polymerase ist eine thermostabile DNA-Polymerase, die ich nach dem thermophilen eubakteriellen Mikroorganismus benannt habe Thermus aquaticus, aus dem es ursprünglich von Chien et al. im Jahr 1976.[1] Sein Name wird oft mit abgekürzt Taq oder Taq pol. Es wird häufig in der Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet, einer Methode zur starken Amplifikation der Menge kurzer DNA-Segmente.

T. aquaticus ist ein Bakterium, das in heißen Quellen und hydrothermalen Quellen lebt Taq Polymerase wurde identifiziert[1] als Enzym, das den während der PCR erforderlichen Protein-Denaturierungsbedingungen (hohe Temperatur) standhalten kann.[2] Daher ersetzte es die DNA-Polymerase aus E coli ursprünglich in der PCR verwendet.[3]

Enzymatische Eigenschaften[edit]

Taq ‘Die optimale Aktivitätstemperatur beträgt 75–80 ° C mit einer Halbwertszeit von mehr als 2 Stunden bei 92,5 ° C, 40 Minuten bei 95 ° C und 9 Minuten bei 97,5 ° C und kann einen 1000-Basenpaar-Strang von replizieren DNA in weniger als 10 Sekunden bei 72 ° C.[4] Bei 75-80 ° C Taq erreicht seine optimale Polymerisationsrate von etwa 150 Nukleotiden pro Sekunde pro Enzymmolekül, und Abweichungen vom optimalen Temperaturbereich hemmen die Verlängerungsrate des Enzyms. Eine einzige Taq synthetisiert etwa 60 Nukleotide pro Sekunde bei 70 ° C, 24 Nukleotide / s bei 55 ° C, 1,5 Nukleotide / s bei 37 ° C und 0,25 Nukleotide / s bei 22 ° C. Bei Temperaturen über 90 ° C Taq zeigt sehr wenig oder gar keine Aktivität, aber das Enzym selbst denaturiert nicht und bleibt intakt.[5] Das Vorhandensein bestimmter Ionen im Reaktionsgefäß beeinflusst auch die spezifische Aktivität des Enzyms. Kleine Mengen Kaliumchlorid (KCl) und Magnesiumionen (Mg2+) fördern Taqenzymatische Aktivität. Taq Die Polymerase wird bei 50 mM KCl und genau der richtigen Mg-Konzentration maximal aktiviert2+ Dies wird durch die Konzentration von Nucleosidtriphosphaten (dNTPs) bestimmt. Hohe Konzentrationen an KCl und Mg2+ hemmen TaqAktivität.[6] Interessanterweise bindet der übliche Metallionen-Chelator EDTA direkt an Taq in Abwesenheit dieser Metallionen.[7]

Einer von Taq ‘Die Nachteile sind das Fehlen einer 3′- bis 5′-Exonuklease-Korrekturleseaktivität[4] Dies führt zu einer relativ geringen Replikationstreue. Ursprünglich wurde seine Fehlerrate bei etwa 1 von 9.000 Nukleotiden gemessen.[8] Einige thermostabile DNA-Polymerasen wurden aus anderen thermophilen Bakterien und Archaeen isoliert, wie z Pfu DNA-Polymerase, die eine Korrekturleseaktivität besitzt und anstelle von (oder in Kombination mit) verwendet wird Taq für High-Fidelity-Verstärkung.[9] Die Wiedergabetreue kann zwischen den Taqs stark variieren und tiefgreifende Auswirkungen auf nachgeschaltete Sequenzierungsanwendungen haben.[10]

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Taq stellt DNA-Produkte her, die an ihren 3′-Enden A (Adenin) -Überhänge aufweisen. Dies kann bei der TA-Klonierung nützlich sein, wobei ein Klonierungsvektor (wie ein Plasmid) verwendet wird, der einen T (Thymin) 3′-Überhang aufweist, der mit dem A-Überhang des PCR-Produkts ergänzt wird, wodurch die Ligation des PCR-Produkts in ermöglicht wird der Plasmidvektor.

In den frühen 1980er Jahren arbeitete Kary Mullis bei der Cetus Corporation an der Anwendung synthetischer DNAs in der Biotechnologie. Er war mit der Verwendung von DNA-Oligonukleotiden als Sonden zur Bindung an Ziel-DNA-Stränge sowie deren Verwendung als Primer für die DNA-Sequenzierung und die cDNA-Synthese vertraut. 1983 begann er, zwei Primer zu verwenden, einen zur Hybridisierung an jeden Strang einer Ziel-DNA und die Zugabe von DNA-Polymerase zur Reaktion. Dies führte zu einer exponentiellen DNA-Replikation.[11] stark amplifizierende diskrete DNA-Segmente zwischen den Primern.[3]

Nach jeder Replikationsrunde muss das Gemisch jedoch über 90 ° C erhitzt werden, um die neu gebildete DNA zu denaturieren, damit sich die Stränge trennen und in der nächsten Amplifikationsrunde als Matrizen fungieren können. Dieser Erhitzungsschritt inaktiviert auch die DNA-Polymerase, die vor der Entdeckung von verwendet wurde Taq Polymerase, das Klenow-Fragment (bezogen aus E coli). Taq Polymerase ist für diese Anwendung gut geeignet, da sie der Temperatur von 95 ° C standhalten kann, die für die DNA-Strangtrennung ohne Denaturierung erforderlich ist.

Verwendung des Thermostats Taq ermöglicht die Durchführung der PCR bei hoher Temperatur (~ 60 ° C und höher), was eine hohe Spezifität der Primer ermöglicht und die Produktion unspezifischer Produkte wie Primerdimer reduziert. Durch die Verwendung einer thermostabilen Polymerase entfällt außerdem die Notwendigkeit, jeder Runde des Thermocyclings ein neues Enzym hinzuzufügen. Ein einzelnes geschlossenes Rohr in einer relativ einfachen Maschine kann verwendet werden, um den gesamten Prozess durchzuführen. Somit ist die Verwendung von Taq Polymerase war die Schlüsselidee, die die PCR auf eine Vielzahl molekularbiologischer Probleme bei der DNA-Analyse anwendbar machte.[2]

Patentfragen[edit]

Hoffmann-La Roche kaufte schließlich die PCR und Taq Patente von Cetus für 330 Millionen US-Dollar, von denen das Unternehmen möglicherweise Lizenzgebühren in Höhe von bis zu 2 Milliarden US-Dollar erhalten hat.[12] 1989 wurde das Science Magazine benannt Taq Polymerase sein erstes “Molekül des Jahres”. Kary Mullis erhielt 1993 den Nobelpreis für Chemie, den einzigen, der für Forschungsarbeiten in einem Biotechnologieunternehmen vergeben wurde. In den frühen 1990er Jahren wurde die PCR-Technik mit Taq Polymerase wurde in vielen Bereichen eingesetzt, einschließlich molekularbiologischer Grundlagenforschung, klinischer Tests und Forensik. Es fand auch eine dringende Anwendung beim direkten Nachweis von HIV bei AIDS.[13]

Im Dezember 1999 entschied der US-Bezirksrichter Vaughn Walker, dass das Patent von 1990 betroffen sei Taq Polymerase wurde teilweise aufgrund irreführender Informationen und falscher Behauptungen von Wissenschaftlern der Cetus Corporation ausgegeben. Das Urteil unterstützte eine Anfechtung der Promega Corporation gegen Hoffman-La Roche, die die Taq Patente im Jahr 1991. Richter Walker zitierte frühere Entdeckungen von anderen Labors, einschließlich des Labors von Professor John Trela in der Abteilung für Biowissenschaften der Universität von Cincinnati als Grundlage für das Urteil.[14]

Domänenstruktur[edit]

Taq PolA hat eine ähnliche Gesamtstruktur wie E coli PolA. Die mittlere 3′-5′-Exonuklease-Domäne, die für das Korrekturlesen verantwortlich ist, wurde dramatisch verändert und ist nicht funktionsfähig.[15] Es hat eine funktionelle 5′-3′-Exonuklease-Domäne am Amino-Terminal, wie nachstehend beschrieben. Die verbleibenden zwei Domänen wirken koordiniert über eine gekoppelte Domänenbewegung.[16]

Exonuklease-Domäne[edit]

Taq Polymerase-Exonuklease ist eine Domäne, die im Amino-Terminal von gefunden wird Taq DNA-Polymerase I (thermostabil). Es wird ein Ribonuklease-H-ähnliches Motiv angenommen. Die Domäne verleiht der Polymerase 5′-3′-Exonukleaseaktivität.[17]

Im Gegensatz zur gleichen Domain in E coli, die Primer abbauen würden und durch Verdauung für die PCR-Verwendung entfernt werden müssen,[9] Diese Domäne soll den Primer nicht abbauen.[18] Diese Aktivität wird in der TaqMan-Sonde verwendet: Während die Tochterstränge gebildet werden, kommen die zur Matrize komplementären Sonden mit der Polymerase in Kontakt und werden in fluoreszierende Stücke gespalten.[19]

Bindung mit DNA[edit]

Taq Die Polymerase ist an ihrer Spalte des aktiven Zentrums der Polymerase mit dem stumpfen Ende der Duplex-DNA gebunden. Als die Taq Die Polymerase steht in Kontakt mit der gebundenen DNA, ihre Seitenketten bilden Wasserstoffbrücken mit den Purinen und Pyrimidinen der DNA. Die gleiche Region von Taq Polymerase, die an DNA gebunden hat, bindet auch an Exonuklease. Diese Strukturen sind an die gebunden Taq Polymerase haben unterschiedliche Wechselwirkungen.

Mutanten[edit]

Ein ortsspezifisches Mutageneseexperiment, das die 3′-5′-Exonukleaseaktivität des Rests um den Faktor 2 verbessert, wurde berichtet, es wurde jedoch nie berichtet, ob dies die Fehlerrate verringert.[20] Nach einem ähnlichen Gedankengang wurden Chimärenproteine ​​durch Kirschpflücken von Domänen aus hergestellt E coli, Taq, und T. neapolitana Polymerase I. Austauschen der Restdomäne gegen eine funktionelle aus E coli schuf ein Protein mit Korrekturlesefähigkeit, aber niedrigerer optimaler Temperatur und geringer Thermostabilität.[21]

Es wurden Versionen der Polymerase ohne die 5′-3′-Exonuklease-Domäne hergestellt, darunter Klentaq oder der Stoffel Fragment sind am bekanntesten. Das völlige Fehlen der Exonukleaseaktivität macht diese Varianten für Primer mit Sekundärstruktur sowie zum Kopieren von zirkulären Molekülen geeignet.[9] Andere Variationen umfassen die Verwendung Klentaq mit einer High-Fidelity-Polymerase, a Thermosequenase Dies erkennt Substrate wie die T7-DNA-Polymerase, Mutanten mit höheren Inhibitortoleranzen oder “domänenmarkierte” Versionen, die ein zusätzliches Helix-Haarnadel-Helix-Motiv um die katalytische Stelle aufweisen, um die DNA trotz widriger Bedingungen fester zu halten.[22]

Bedeutung bei der Erkennung von Krankheiten[edit]

Wegen der Verbesserungen Taq Polymerase, die bei der PCR-DNA-Replikation bereitgestellt wird: Höhere Spezifität, weniger unspezifische Produkte und einfachere Verfahren und Geräte. Sie war maßgeblich an den Bemühungen zum Nachweis von Krankheiten beteiligt. “Die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) bei der Diagnose von Infektionskrankheiten hat zu einer Fähigkeit geführt, Krankheiten aufgrund anspruchsvoller Krankheitserreger frühzeitig zu diagnostizieren und angemessen zu behandeln, die antimikrobielle Anfälligkeit langsam wachsender Organismen zu bestimmen und das Infektionsquantum zu bestimmen.” [23] Die Implementierung von Taq Polymerase hat unzählige Leben gerettet. Es hat eine wesentliche Rolle bei der Erkennung vieler der weltweit schlimmsten Krankheiten gespielt, darunter: Tuberkulose, Streptokokken-Pharyngitis, atypische Pneumonie, AIDS, Masern, Hepatitis und ulzerative Urogenitalinfektionen. Die PCR, die Methode zur Neuerstellung von Kopien spezifischer DNA-Proben, ermöglicht den Nachweis von Krankheiten, indem eine spezifische DNA-Sequenz eines zielgerichteten Pathogens aus der Probe eines Patienten gezielt und Spurenmengen der indikativen Sequenzen durch milliardenfaches Kopieren amplifiziert werden. Obwohl dies die genaueste Methode zur Erkennung von Krankheiten ist, insbesondere bei HIV, wird sie aufgrund der relativ hohen Kosten, des Arbeitsaufwands und des Zeitaufwands nicht so oft wie alternative, minderwertige Tests durchgeführt.[24]

Das Vertrauen auf Taq Polymerase als Katalysator für den PCR-Replikationsprozess wurde während der COVID-19-Pandemie von 2020 hervorgehoben. Der Mangel an dem erforderlichen Enzym hat die Fähigkeit von Ländern weltweit beeinträchtigt, Testkits für das Virus herzustellen. Ohne Taq Polymerase, der Krankheitserkennungsprozess ist viel langsamer und langwieriger.[25]

Trotz der Vorteile der Verwendung Taq Polymerase bei der Erkennung von PCR-Erkrankungen ist das Enzym nicht ohne Mängel. Retrovirale Erkrankungen: HIV, HTLV-1 und HTLV-II; enthalten häufig Mutationen von Guanin zu Adenin in ihrem Genom. Mutationen wie diese ermöglichen es PCR-Tests, die Krankheiten aber zu erkennen Taq Die relativ niedrige Wiedergabetreue der Polymerase führt dazu, dass dieselbe G-zu-A-Mutation auftritt und möglicherweise ein falsch positives Testergebnis liefert.[26]

Siehe auch[edit]

Verweise[edit]

  1. ^ ein b Chien A, Edgar DB, Trela ​​JM (September 1976). “Desoxyribonukleinsäure-Polymerase aus dem extrem thermophilen Thermus aquaticus”. Journal of Bacteriology. 127 (3): 1550–7. doi:10.1128 / jb.127.3.1550-1557.1976. PMC 232952. PMID 8432.
  2. ^ ein b Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S., Scharf SJ, Higuchi R., Horn GT, et al. (Januar 1988). Primer-gerichtete enzymatische Amplifikation von DNA mit einer thermostabilen DNA-Polymerase. Wissenschaft. 239 (4839): 487–91. Bibcode:1988Sci … 239..487S. doi:10.1126 / science.239.4839.487. PMID 2448875.[permanent dead link]
  3. ^ ein b Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. (Dezember 1985). Enzymatische Amplifikation von Beta-Globin-Genomsequenzen und Restriktionsstellenanalyse zur Diagnose von Sichelzellenanämie. Wissenschaft. 230 (4732): 1350–4. Bibcode:1985Sci … 230.1350S. doi:10.1126 / science.2999980. PMID 2999980. Archiviert von das Original am 19.12.2008.
  4. ^ ein b Rechtsanwalt FC, Stoffel S., Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, Gelfand DH (Mai 1993). “Hochgradige Expression, Reinigung und enzymatische Charakterisierung der Thermus aquaticus-DNA-Polymerase in voller Länge und einer verkürzten Form, der die 5′- bis 3′-Exonukleaseaktivität fehlt.”. PCR-Methoden und -Anwendungen. 2 (4): 275–87. doi:10.1101 / gr.2.4.275. PMID 8324500.
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