サーモスタビルDNA-ポリメラーゼ – ウィキペディア

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taq – エキソヌクレアーゼを備えたDNAポリメラーゼ（左上）およびDNAを伴うポリマー型（右下）

サーモスタビルDNA-ポリメラセン 熱線系からのDNAポリメラーゼであり、ほとんどが細菌または古細菌の種であり、したがって熱安定性です。これらは、ポリメラーゼ連鎖反応と、DNAの重複と修飾のための関連方法に使用されます。

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天然起源の熱安定性DNAポリメラーゼは、特に熱性細菌、角およびその病原性で発生します。細菌のサーモスタビルDNAポリメラーゼの下では、Taqポリメラーゼ、 TFL – ポリメラーゼthat TMA – ポリメラーゼthat tne – ポリメラーゼと tth – 使用したポリメラーゼ。 [初め] [2] [3]

A型DNAポリメラーゼに属する細菌の熱スタビリックDNAポリメラーゼは、5 ‘→3’-ポリメラーゼ活性を持っています 5 ‘→3’-エキソヌクレアーゼ活性 アデノシンオーバーハング（英語）を作成します。 英語 粘着性の端 ）。
プロセス性（英語 加工性 ）DNAテンプレートからのポリメラーゼの前の塩基対の平均数を説明してください。 レンプレート ）ドロップ。使用されたポリメラーゼの加工性は、リアルタイムの定量的PCRでプライマーの最大距離をプローブに制限します。 TAQポリメラーゼの加工性は、約200塩基対です。

PFU – 2つのマグネシウムイオン（灰色のボール）を備えたポリメラーゼ

Bタイプの頻繁に使用されるDNAポリメラーゼは、さまざまな古細菌のPFUポリメラーゼです。 [初め] PWOポリメラーゼ、 コード – ポリメラーゼ、 [4] tli -polymerase（また 排出する 呼ばれた）、 [5] 鬼ごっこ – ポリメラーゼ、 [6] tce – ポリメラーゼ、 [7] tgo – ポリメラーゼ、 [8] TNA1 – ポリメラーゼ、 [9] TPE – ポリメラーゼ、 [十] tthi – ポリメラーゼ、 [11] neq – ポリメラーゼ [12番目] そしてその ヘルプ – ポリメラーゼ。 [13]

B型に属する古風なバリアントは、オーバーハングを作成しません。 鈍い終わり 、 tli -polymeraseは製品の約30％で張り出します） 5 ‘→3’-エキソヌクレアーゼ活性 合成エラーを修正するためのアクティビティ。 校正 ）、 3 ‘→5’-エキソヌクレアーゼ活性 。 [14] [15] 古風なポリメラーゼでは、矯正エキソヌクレアーゼ活性が除去されるため、類似のクレノウフラグメントを作成するとエラー率が低下します。 [初め] Archaeenの一部のDNAポリメラーゼは、標準のPCRに対する適合性によってあまり特徴付けられていませんが、AdNAの増幅における阻害の減少によってはあまり特徴付けられていません。 [16]

さまざまなサーモスタブルポリメラーゼとサーモスタブルDNA結合タンパク質のDNAクリップで作られたタンパク質設計 SSO7D 低誤差率の古風な肉と生成された細菌の熱安定性DNAポリメラーゼの高い合成を伴う異なる融合タンパク質（ Q5 -polymerase）。 [17] PCNAホモログの融合タンパク質 Archaeoglobusは輝いています 古風なサーモスタビルDNAポリメラーゼが生成されます。 [18] トポイソメラーゼの熱安定性DNA結合タンパク質ドメインを使用した熱安定性DNAポリメラーゼの類似融合タンパク質（型Vの型、 Helix-Hairpin-Helix-Motiv 、 HHH ）out メタノピラス・カンドレリ 生成された（ TOPOTAQ と PFUC2 ）。 [19] [20] 修正されたものもタンパク質設計によって作成されました PFU – ポリメラーゼ生成（ PFUウルトラ ）。 [21] 同様の効果は、両方のタイプの熱安定性DNAポリメラーゼの混合物でも達成されます。30〜1のタイプAおよびBのポリメラーゼの酵素活性の混合比、 [十] [22] z。 B.死ぬ ヘルカラーゼ の商業的なミックスとして taq – そしてその PFU – ポリメラーゼ。 [8]

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さまざまなポリメラーゼの基本的な儀式（英語 生産性 ）比較されました。 [8] の合成 taq -polymeraseは、約60塩基ペアあたりです。変更されていないサーモスタビルDNAポリメラーゼの下で、の合成速度のみ コード – 100秒あたり100ペアを超えるポリメラーゼ（約120 bp/s）。 [23] 合成酸塩を増加させる修飾されたサーモスタビルDNAポリメラーゼの中でさまざまな変異が報告されています。 [24] [25] コード – ポリメラーゼといくつかの修飾されたサーモスタビルDNAポリメラーゼ（ iProof 、 PFUウルトラ 、 フュージョン 、 速度 また z-taq ）合成率が高いため、短い増幅サイクルを備えたPCRバリアントが使用されます（ 高速-PCR 、 高速PCR ）。

異なるポリメラーゼのエラー率（英語 忠実 ）知られており、説明されています。のエラー率 taq – ポリメラーゼは8・10です -6 ベースペアごとのエラー コード – ポリメラーゼ3,5・10 -6 ベースペアごとのエラー tli – ポリメラーゼと ヘルカラーゼ 2.8・10 -6 ベースペアごとのエラー PFU – ポリメラーゼ1,3・10 -6 ベースペアごとのエラーとのエラー PFUウルトラ 4.3・10 -7 ベースペアごとのエラー。 [初め] [8]

細菌のサーモスタブルDNAポリメラーゼの場合、DNAポリメラーゼに類似しています 大腸菌 タンパク質設計の過程でエキソヌクレアーゼドメインの削除、クレノウフラグメント（ ケル – それ ）またはファブリックフラグメントを作成することができ、その結果、製品濃度が高くなります。 [26] [2] のエキソヌクレアーゼ関数の2つ taq – ポリメラーゼ必要なアミノ酸は、突然変異誘発によって25および74の位置でアルギニンとして同定されました（R25およびR74）。 [27]

熱安定性DNAポリメラーゼによる個々のヌクレオチドの好みは、ヌクレオチド特異性です（英語。 バイアス 「好み」、「バイアス」）。チェーン終端基質（Office Oxymethode）を使用したPCRベースのDNAシーケンスにより、それらの均一な設置、したがって、すべてのチェーンブレイクアウト製品の均等な世代が望ましいため、より多くの感度と容易な評価を可能にします。これを行うには、1つ クレンタック – 削除によって生成され、局所特異的突然変異誘発（短い：F667y）を介してチロシンの位置667のフェニルアラニンを交換したポリメラーゼ サーモシーケナーゼ 専用。 [28] [29] このポリメラーゼは、蛍光マークされたディスオキシノクレオチドの設置にも使用できます。 [30]

andere dna-polymerasen [ 編集 | ソーステキストを編集します ]

等温のDNA増幅、例えばB.マルチディスプレースメント増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅または等温アセンブリは、DNAポリメラーゼを使用したゲノム全体の増幅（例：バクテリオファージのφ29DNAポリメラーゼ PHI29 ）サーマリーストップではありません。 T4 – 、 T6 – そしてその T7 -DNAポリメラーゼもサーモスタブルではありません。

使用されるサーモスタブルDNAポリメラーゼの選択に加えて、PCRの最適化の過程でPCRのさらなるパラメーターが特に変更されます。

PCRに加えて、サーモスタビルDNAポリメラーゼは、RT-PCRのバリアント、異なるバリアントのQPCR、局所特異的変異誘発、およびDNAシーケンスにも使用されます。さらに、サザンブロットとノーザンブロットのハイブリダイゼーションプローブもランダムプライミングによって生成されます。 5 ‘→3’-エキソヌクレアーゼ活性 ニック翻訳やタクマンなど、DNAの増加（増幅）なしで使用されます。

  1. ↑ a b c d J. Cline、J。C。Braman、H。H。Hogrefe： PFU DNAポリメラーゼおよびその他の熱安定性DNAポリメラーゼのPCR忠実度。 の： 核酸res。 、bd。 24、nr。 18、1996、S。3546–3551。 PMID 8836181 ; PMC 146123 （無料の全文）。
  2. ↑ a b B.スターポプランド、H。スーブ、B。フライ、D。シンブルク： ドメイン交換：Thermus aquaticus DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼIおよびThermotoga neapolitana DNAポリメラーゼのキメラ。 の： タンパク質1。 、bd。 13、nr。 9、2000、S。645–654。 PMID 11054459 。
  3. ↑ W. Abu Al-Soud、P。Râdström： PCR阻害サンプルの存在下でDNA増幅を媒介する9つのサーモスタブルDNAポリメラーゼの容量。 の： Appl。環境。マイクロビオール。 、bd。 64、nr。 10、1998、S。3748–3753。 PMID 9758794 ; PMC 106538 （無料の全文）。
  4. ↑ M. Takagi, M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka, T. Imanaka: Pyrococcus sp。からのDNAポリメラーゼの特性評価KOD1株とPCRへの適用。 の： Appl。環境。マイクロビオール。 、bd。 63、nr。 11、1997、S。4504–4510。 PMID 9361436 ; PMC 168769 （無料の全文）。
  5. ↑ H. Kong、R。B。Kucera、W。E。Jack： Hyperthermophile Archaea Thermococcus litoralisからのDNAポリメラーゼの特性評価。ベントDNAポリメラーゼ、定常状態の速度論、熱安定性、加工性、鎖変位、およびエキソヌクレアーゼ活性。 の： J Biol Chem。 、bd。 268、nr。 3、1993、S。1965–1975。 PMID 8420970 。
  6. ↑ K.Böhlke、F。M。Pisani、C。E。Vorgias、B。Frey、H。Torn、M。Rossi、G。Antranそのような： 好熱性EuryARACHAEON Thermococcus AggregansからのB型DNAポリメラーゼのPCRパフォーマンスは、Y-GG/Aモチーフの変異によって改善されました。 の： 核酸res。 、bd。 28、nr。 20、2000、S。3910–3917。 PMID 11024170 ; PMC110800 （無料の全文）。
  7. ↑ K. P.キム、H。ベイ、I。H。キム、S。T。クォン：高温疾患のアルケオン、Thermococcus CelerからのDNAポリメラーゼのクローニング、発現、およびPCR応用。の： Biotechnol Lett。 （2011）、bd。 33（2）、S。339–46。 PMID 20953664 。
  8. ↑ a b c d Bahram Arezi、Weimei Xing、Joseph A. Sorge、Holly H. Hogrefe： サーモスタブルDNAポリメラーゼの増幅効率 。の： 分析生化学 。 バンド 321 、 いいえ。 2 、15。2003年10月、 S. 226–235 、doi： 10.1016/S0003-2697（03）00465-2 、 PMID 14511688 （ PDF ）。
  9. ↑ Y.チョー、H。S。リー、Y。J。キム、S。G。カン、S。J。キム、J。H。リー： 高温疾患のアルケオン熱球Onnurineus Na1からのDutPaseの特性評価とポリメラーゼ連鎖反応増幅におけるその応用 。の： Mar Biotechnol（NY） 、bd。 9、nr。 4、2007、S。450–458。 PMID 17549447 。
  10. ↑ a b J. I.リー、Y。J。キム、H。Bae、S。S。チョー、J。H。リー、S。T。Kwon： 高温ヒモフィリックEuryararcheon Thermococcus PeptonophilusからのファミリーB DNAポリメラーゼの生化学的特性とPCR性能。 の： Appl Biochem Biotechnol。 、bd。 160、nr。 6、2010、S。1585–1899。 PMID 19440663 。
  11. ↑ D.マルシック、J。M。フラマン、J。D。NG： 高血圧系マリンアーチオン熱coccusチオール葉からの新しいDNAポリメラーゼ。 の： 極限 、bd。 12、nr。 6、2008、S。775–788。 PMID 18670731 。
  12. ↑ J. G.ソング、E。J。キル、S。S。チョー、I。H。キム、S。T。クォン： 指の中央にあるアミノ酸残基は、NEQ DNAポリメラーゼの加工性に関与しています：操作されたNEQ DNAポリメラーゼの加工性とそのPCRアプリケーション。 の： タンパク質1。期限。自分自身。 、bd。 23、nr。 11、2010、S。835–842。 PMID 20851826 。
  13. ↑ J. Dietrich、P。Life、B。L。Ronland、Ha。Clubihi、Y。Guigues： Pyrococcus abyssiからの高度な熱安定性校正B型DNAポリメラーゼのPCRパフォーマンス。 の： FEMS Microbiol Lett。 、bd。 217、nr。 1、2002、S。89–94。 PMID 12445650 。
  14. ↑ E. M. Kennedy、C。Hergott、S。Dewhurst、B。Kim：サーモスタブルPyrococcus FuriosusファミリーB DNAポリメラーゼモチーフAおよびDNTP基質との相互作用の機械的アーキテクチャ。の： 生化学 （2009）、bd。 48（47）、S。11161–8。 PMID 19817489 ; PMC 3097049 （無料の全文）。
  15. ↑ T. kuroita、H。Matsumura、N。Zokota、M。Kitabayashi、H。Hashimoto、T。Inoue、T。Imanaka、Y。Kai：古頭DNAポリメラーゼにおける校正およびポリメラーゼ活性の調整のための構造メカニズム。の： J Mol Biol。 （2005）、bd。 351（2）、S。291–8。 PMID 16019029 。
  16. ↑ J. P.マクドナルド、A。ホール、D。ガスパート、J。カデット、J。バランタイン、R。ウッドゲート：新しいサーモスタブルYファミリーポリメラーゼ：損傷または古代DNAのPCR増幅のための応用。の： 核酸res。 （2006）、bd。 34（4）、S。1102–11。 PMID 16488882 ; PMC 1373694 （無料の全文）。
  17. ↑ Y. Wang、D。E。Prosen、L。Mei、J。C。Sullivan、M。Finney、P。B。Vander Horn：in vitroでのプロセス性の向上とパフォーマンスの向上のためにDNAポリメラーゼを設計するための新しい戦略。の： 核酸res。 （2004）、bd。 32（3）、S。1197–207。 PMID 14973201 ; PMC 373405 （無料の全文）。
  18. ↑ M. Motz、I。Kober、C。Girardot、E。Loeser、U。Bauer、M。Albers、G。Moeckel、E。Minch、H。Voss、C。Kilger、M。Koegl： 拡張されたPCR酵素を生成するための古細菌複製タンパク質ネットワークの解明 。の： J Biol Chem。 （2002）、バンド277（18）、S。16179–88。 PMID 11805086 。 PDF 。
  19. ↑ P.デザイン： DNAトポイソメラーゼV：神秘的な起源の新しいfold 。の： トレンドバイオテクノール 。 Vol。 24、 いいえ。 6 、2006、 S. 245–247 、doi： 10.1016/j.tibtech。2006.04.006 、 PMID 16650908 。
  20. ↑ A. R. Pavlov、N。V。Pavlova、S。A。Kozyavkin、A。I。Slesarev： 効率的なアプリケーションのためのサーモスタブルDNAポリメラーゼの最適化における最近の開発 。の： トレンドバイオテクノール 。 バンド 22 、 いいえ。 5 、2004、 S. 253–260 、doi： 10.1016/j.tibtech.2004.02.011 、 PMID 15109812 。
  21. ↑ ホリーH.ホグルフェ、M。ボーンズ： 高忠実度PCR酵素 。 In：C.W。Dieffenbach、G.S。Dveksler（編）： PCRプライマー：実験室マニュアル 、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、2003。
  22. ↑ W. M. Barnes：Lambda Bacteriophageテンプレートからの高い忠実度と高収量の最大35 kb DNAのPCR増幅。の： Proc Natl Acad Sci U S a （1994）、bd。 91（6）、S。2216–20。 PMID 8134376 ; PMC 43341 （無料の全文）。
  23. ↑ 特許 EP1752534A1 ： 高速DNAポリメラーゼを使用した高速PCR。 登録 12. 2005年5月 、オンに公開されています 2007年2月14日 、Ampelder：Toyo Boseki、Erfinder：Masaya Segawa et al。 ‌
  24. ↑ 特許 US2013034879A1 ： DNAポリメラーゼ。 登録 2. 2012年8月 、オンに公開されています 2007年2月14日 、Anmelder：Enzyme Uab et al、Erfinder：Remigijus skirgaila et al。 ‌
  25. ↑ 特許 US2009280539A1 ： DNAポリメラーゼおよび関連する方法。 登録 16. 2009年4月 、オンに公開されています 12. 2009年11月 、登録：Roche Molecular Systems Inc、発明家：キースA.バウアー。 ‌
  26. ↑ W. M.バーンズ： PCRを触媒するTAQポリメラーゼの忠実度は、N末端の欠失によって改善されます 。の： 遺伝子 （1992）、バンド112（1）、S。29–35。 PMID 1551596 。
  27. ↑ L. S.メルケンズ、S。K。ブライアン、R。E。モーゼス： Thermus aquaticus DNAポリメラーゼの5′-3 ‘エキソヌクレアーゼの不活性化。 の： Biochim Biophys Acta （1995）、バンド1264（2）、S。243–8。 PMID 7495870 。
  28. ↑ S.タボール、C。C。リチャードソン： 大腸菌DNAポリメラーゼIファミリーのDNAポリメラーゼの単一残基は、デオキシとジデオキシリボヌクレオチドを区別するために重要です。 の： Proc Natl Acad Sci U S A. 、バンド92、nr。 14、1995、S。6339-6343。 PMID 7603992 ; PMC 41513 （無料の全文）。
  29. ↑ P. B. Vander Horn、M。C。Davis、J。J。Cunniff、C。Ruan、B。F。McArdle、S。B。Samols、J。Szasz、G。Hu、K。M。Hujer、S。T。Domke、S。R。Brummet、R。B。Moffett、C。W。Fuller： Thermo Sequenase DNAポリメラーゼおよびT.酸性疾患ピロスファターゼ：DNAシーケンスのための新しいサーモスタブル酵素。 の： バイオテクニック 、バンド22、nr。 4、1997、S。758-172、764-765。 PMID 9105629 。
  30. ↑ J. M. Prober、G。L。Trainor、R。J。Dam、F。W。Hobbs、C。W。Robertson、R。J。Zagursky、A。J。Cocuzza、M。A。Jensen、K。Baumeister： 蛍光鎖ターミネートジデオキシヌクレオチドを使用した迅速なDNAシーケンスのシステム。 の： 化学 、バンド238、nr。 4825、1987、S。336-341。 PMID 2443975 。
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